楊燕，孫倩，孫長貴

(中國人民解放軍第一一七醫(yī)院檢驗科，杭州 310013)

耳念珠菌研究進展

楊燕，孫倩，孫長貴

(中國人民解放軍第一一七醫(yī)院檢驗科，杭州 310013)

耳念珠菌是一種近年來出現(xiàn)的酵母，可引起侵襲性感染，對氟康唑等抗真菌藥物呈現(xiàn)多重耐藥性，感染患者具有較高的死亡率。傳統(tǒng)的實驗室表型鑒定方法可能會導(dǎo)致錯誤鑒定結(jié)果，需要采用分子生物學(xué)方法或質(zhì)譜技術(shù)區(qū)別耳念珠菌與其他念珠菌。因此，應(yīng)引起臨床和實驗室人員的關(guān)注，注意感染防控。

耳念珠菌；耐藥性；感染

近30多年來，真菌感染在醫(yī)院感染中越來越常見，感染發(fā)生率也在上升。耳念珠菌(Candidaauris)是一種近年來出現(xiàn)的酵母，2009年由日本學(xué)者首先報道[1]。此后，在世界各地陸續(xù)出現(xiàn)其引起感染的報道[2-6]。該菌株可引起侵襲性感染，對氟康唑等抗真菌藥物呈現(xiàn)多重耐藥性，感染患者具有較高的死亡率，已引起國外學(xué)者的關(guān)注。本文簡要綜述耳念珠菌的研究進展。

1 流行病學(xué)

耳念珠菌于2009年首先由日本學(xué)者報道，分離于一住院老年女性患者外耳道[1]。此后，韓國[2-3]、印度[4]、南非[5]和科威特[6]等國家學(xué)者陸續(xù)報道耳念珠菌引起臨床感染病例，尤其是真菌血癥。耳念珠菌除可引起血流感染、傷口感染和耳炎，也可分離自呼吸道和尿液標(biāo)本，但從這些部位分離出菌株是否表示感染或定植還不清楚。在巴西、哥倫比亞、委內(nèi)瑞拉、美國、英國和巴基斯坦也有該菌株被檢出[7-10]。

耳念珠菌感染可引起醫(yī)院內(nèi)暴發(fā)流行，涉及不同年齡段患者，感染途徑與其他病原性念珠菌感染類似。感染的危險因素通常也與其他念珠菌相似，包括糖尿病、手術(shù)、使用抗生素或抗真菌藥物、接受化療、慢性腎病透析、HIV感染、機械通氣、導(dǎo)尿管和中心靜脈導(dǎo)管的使用等[4,8,11]。

擴增片段長度多態(tài)性和多位點序列分型結(jié)果表明，盡管在同一國家或地區(qū)內(nèi)引起感染的菌株有關(guān)聯(lián)，但不同國家之間感染菌株的基因型可有所區(qū)別[4,7-8,12-13]。這種差異的原因以及傳播機制尚不可知。

鑒于耳念珠菌的感染和流行，美國疾病控制與預(yù)防中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)和英國公共衛(wèi)生部(Public Health England，PHE)分別發(fā)布了有關(guān)耳念珠菌感染的醫(yī)療機構(gòu)臨床警示和實驗室研究、管理和感染預(yù)防控制指南[9-10]。提醒醫(yī)療機構(gòu)人員應(yīng)重視和認真對待耳念珠菌引起的感染。

2 生物學(xué)特性與鑒定

2.1 生物學(xué)特性 文獻[1]描述：在含葡萄糖、酵母浸膏和蛋白胨肉湯培養(yǎng)基中25 ℃培養(yǎng)3 d，可形成沉淀物，菌細胞呈卵圓形、橢圓形或拉長，大小(2.0～3.0) μm ×(2.5～5.0) μm，成單、雙或成群排列。在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)1個月后，劃線培養(yǎng)物呈黏性奶油狀，灰白色，邊緣光滑和反光。在玻片玉米粉瓊脂培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)59 d不產(chǎn)生假菌絲。最適生長溫度為37～40 ℃；在42 ℃緩慢和弱生長，而45 ℃則不生長?？稍跓o維生素培養(yǎng)基生長，在50%葡萄糖和10%氯化鈉/5%葡萄糖培養(yǎng)基中生長良好。在含0.1%和0.01%的放線菌酮中不生長。發(fā)酵葡萄糖，弱發(fā)酵蔗糖和海藻糖，不發(fā)酵半乳糖、麥芽糖、乳糖或棉子糖。同化葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、D-海藻糖、D-棉子糖、D-松三糖、可溶性淀粉、半乳糖醇、D-甘露醇、山梨醇和檸檬酸鹽，弱同化菊糖、核糖醇，不同化D-半乳糖、L-山梨糖、D-纖維二糖、乳糖、蜜二糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、核糖、L-鼠李糖、D-氨基葡萄糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖(NAG)、甲醇、乙醇、甘油、赤蘚糖醇、α-甲基-D-葡萄糖苷、水楊苷、D-葡萄糖酸鹽，DL-乳酸鹽、琥珀酸鹽、肌醇、十六烷、2-酮基-D-葡萄糖酸鹽和木糖醇。可利用硫酸銨、尸胺和L-賴氨酸作為唯一氮源；不利用亞硝酸鈉、硝酸鉀和乙胺。尿素酶活性和重氮藍B反應(yīng)為陰性。來源于印度、南非和科維特的分離株可同化NAG[4-6]。菌株DNA G + C含量為45.3 mol%。

2.2 鑒定與鑒別 在種系發(fā)生上，耳念珠菌與希木龍念珠菌(Candidahaemulonii)相關(guān)，其生化特性與希木龍念珠菌、Candidaduobushaemulonii和無名念珠菌等菌株相似，常規(guī)表型鑒定易被一些商品化鑒定系統(tǒng)(如Vitek 2和API 20C-AUX)錯誤鑒定為希木龍念珠菌、Candidaduobushaemulonii、無名念珠菌、清酒念珠菌(Candidasake)、釀酒酵母或黏紅酵母[4,8,14]。耳念珠菌無假菌絲和芽管形成，在科瑪嘉念珠菌培養(yǎng)基上呈粉色，能在40 ℃生長，而希木龍念珠菌和Candidaduobushaemulonii可形成假菌絲和芽生孢子，但不能在40 ℃生長[4,14]。黏紅酵母在沙氏培養(yǎng)基上呈粉色，易于鑒別。耳念珠菌雖然在科瑪嘉培養(yǎng)基上呈粉色，但其他幾種念珠菌亦呈粉色，因此顯色培養(yǎng)基不是鑒定耳念珠菌的首選。

目前通過分子生物學(xué)方法如內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)和D1/D2區(qū)域基因測序是鑒定耳念珠菌的金標(biāo)準(zhǔn)[8-10,12,14]。擴增核糖體亞單位ITS區(qū)域使用的引物為ITS-1(5′-TCCGTAGGTGAACCTTGCGG-3′)和 ITS-4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)；大核糖體亞單位D1/D2區(qū)域擴增使用的引物為NL-1(5′-GCATATCAATAAGCGGAG

GAAAAG-3′)和NL-4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)，擴增產(chǎn)物測序后在GenBank上進行堿基局部對準(zhǔn)檢索工具(basic local alignment search tool，BLAST)比對以鑒定到種[12,14]?？捎没|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)獲得該菌的蛋白質(zhì)圖譜，對其進行鑒定[7,12-14]，前提是數(shù)據(jù)庫中有該菌株的數(shù)據(jù)。采用MALDI-TOF MS對耳念珠菌進行鑒定時，根據(jù)廠商對酵母菌鑒定的要求進行操作，均能獲得較高的鑒定分值(分值≥2)[14]。如果常規(guī)表型方法鑒定到希木龍念珠菌、無名念珠菌、清酒念珠菌或釀酒酵母時，應(yīng)進一步做ITS和D1/D2基因測序或MALDI-TOF MS檢測，以排除耳念珠菌的可能。

3 體外藥敏及耐藥

耳念珠菌由于其多重耐藥性，受到國外學(xué)者和權(quán)威機構(gòu)高度關(guān)注[8-10,15-16]。雖然當(dāng)前尚未建立耳念珠菌的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)解釋標(biāo)準(zhǔn)，但參考其他念珠菌的解釋標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)幾乎所有菌株對氟康唑高度耐藥，半數(shù)以上對伏立康唑耐藥，1/3菌株對兩性霉素B耐藥(MIC≥2 μg/mL)，少數(shù)菌株對棘白菌素也耐藥[9-10]。Kathuria等[14]用美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法測定90株耳念珠菌對常用抗真菌藥物的敏感性，結(jié)果顯示對氟康唑、兩性霉素B、5-氟胞嘧啶和卡泊芬凈存在較高的MIC90值，分別為64、4、8和1 μg/mL，對其他抗真菌藥物的MIC范圍、MIC90和MIC50測定結(jié)果見表1。這些對唑類、多烯類和棘白菌素類等主要抗真菌藥物耐藥株的流行，限制了臨床對治療藥物的選擇，給治療該菌株引起的感染帶來很大的困難，應(yīng)引起臨床醫(yī)生的關(guān)注。常規(guī)工作中鑒定到該菌株時，應(yīng)及時進行抗真菌藥物敏感性試驗，以盡早給臨床提供實驗結(jié)果，便于臨床正確選擇藥物。

表1 90株耳念珠菌對常用抗真菌藥物的體外敏感性[14]

注：AMB，兩性霉素B；ITC，伊曲康唑；VRC，伏立康唑；ISA,艾沙康唑；POS，泊沙康唑；FLU，氟康唑；5-FC，5-氟胞嘧啶；CAS，卡泊芬凈；MFG，米卡芬凈；AFG，阿尼芬凈。

目前，耳念珠菌對抗真菌藥物耐藥機制還不是很清楚，其耐藥性可能是在抗真菌藥物選擇壓力下誘導(dǎo)快速突變而導(dǎo)致。最近發(fā)現(xiàn)，耳念珠菌基因組中存在單一拷貝的ERG3、ERG11、FKS1、FKS2和FKS3基因，其基因組的一個重要部分編碼ABC和MFS轉(zhuǎn)運蛋白家族以及藥物轉(zhuǎn)運蛋白，可能是耳念珠菌產(chǎn)生特殊的多重耐藥性的原因[8,17]。

4 感染預(yù)防與控制

最近PHE發(fā)布的指南指出，耳念珠菌定植很難根除且趨于持續(xù)存留。醫(yī)務(wù)人員的工作團隊中必須包括微生物學(xué)專家，其工作必須在專業(yè)的感染控制專家指導(dǎo)下進行[10]。

耳念珠菌感染控制措施包括以下幾點[8,10]。(1)隔離感染或定植患者。(2)醫(yī)務(wù)人員應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)化的接觸預(yù)防措施，包括手衛(wèi)生(如使用肥皂和水洗手后再乙醇搓手)，穿工作服和戴手套。(3)對環(huán)境和污染物采取常規(guī)的感染預(yù)防和控制措施，包括普通清潔推薦使用含氯消毒劑，終末去污染考慮采用過氧化氫蒸氣法或紫外線設(shè)備等。但這些對普通真菌有效的清潔和去污染的方法，對耳念珠菌都未被證實有效；應(yīng)開展體外實驗來研究其效果。耳念珠菌感染或定植患者床旁重復(fù)使用的設(shè)備應(yīng)加強管理和清潔，包括血壓計袖帶和聽診器等每天使用的小設(shè)備以及監(jiān)護設(shè)備和X光機等大設(shè)備。(4)必須與處置其他醫(yī)療相關(guān)多重耐藥微生物一樣，嚴(yán)格處理相關(guān)醫(yī)療廢棄物。

5 結(jié)語

耳念珠菌是一種能引起侵襲性感染并危及生命的多重耐藥菌株，感染多見于念珠菌血癥。由于常見的表型鑒定及微生物鑒定系統(tǒng)均無法準(zhǔn)確鑒定耳念珠菌，因此，常導(dǎo)致臨床微生物學(xué)實驗室對該菌株的鑒定錯誤。正確鑒定該菌株需使用分子生物學(xué)手段如ITS和D1/D2區(qū)域基因測序以及MALDI-TOF MS方法。耳念珠菌對唑類藥物高度耐藥，對其他抗真菌藥物的MIC值也有所提高，其定植亦很難根除且趨于持續(xù)留存。多重耐藥耳念珠菌的感染和流行，給臨床抗感染治療帶來挑戰(zhàn)，應(yīng)引起國內(nèi)臨床醫(yī)生和微生物學(xué)檢驗人員的關(guān)注。

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(本文編輯：劉群)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.01.17

楊燕，1980年生，女，碩士，從事臨床微生物學(xué)檢驗研究。

孫長貴，主任技師，教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail:suncgui@163.com。

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