程闊，于宏偉，馬偉立，何京，楊子軒，馮軍花，張金艷

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院檢驗(yàn)科，石家莊 050000)

·臨床檢驗(yàn)技術(shù)研究·

imCIM檢測(cè)B類碳青霉烯酶的效果評(píng)價(jià)*

程闊，于宏偉，馬偉立，何京，楊子軒，馮軍花，張金艷

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院檢驗(yàn)科，石家莊 050000)

目的 評(píng)價(jià)抑制劑增強(qiáng)改良碳青霉烯失活法(imCIM)在B類碳青霉烯酶檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值，并與EDTA紙片增效試驗(yàn)(EDPT)進(jìn)行比較分析。方法 收集碳青霉烯類抗生素不敏感菌株181株，其中肺炎克雷伯菌44株、大腸埃希菌44株、鮑曼不動(dòng)桿菌43株、銅綠假單胞菌50株；碳青霉烯類抗生素敏感菌株83株，其中肺炎克雷伯菌25株、大腸埃希菌16株、鮑曼不動(dòng)桿菌25株、銅綠假單胞菌17株。采用imCIM和EDPT對(duì)上述264株菌株進(jìn)行B類碳青霉烯酶的篩查，以PCR結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)用一致性檢驗(yàn)、Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)、獨(dú)立樣本Kruskal-WallisH檢驗(yàn)及ROC曲線進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 181株碳青霉烯類抗生素不敏感菌株中144株P(guān)CR擴(kuò)增耐藥基因陽(yáng)性，A、B、D類碳青霉烯酶分別為39株、77株、28株；imCIM檢測(cè)70株陽(yáng)性，111株陰性，其中166株與PCR結(jié)果一致；EDPT檢測(cè)72株陽(yáng)性，109株陰性，其中134株與PCR結(jié)果一致。碳青霉烯類抗生素敏感菌株83株，PCR擴(kuò)增耐藥基因、imCIM及EDPT檢測(cè)結(jié)果均為陰性。imCIM敏感性和特異性分別為85.71%(66/77)和97.86%(183/187)，與PCR結(jié)果一致性Kappa值為0.859；EDPT敏感性和特異性分別為66.23%(51/77)和88.77%(166/187)，Kappa值為0.561。imCIM抑菌圈差值(ΔdimCIM)與EDPT抑菌圈差值(ΔdEDPT)有差別，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-6.941，P<0.05)。采用imCIM檢測(cè)B類碳青霉烯酶的ΔdimCIM水平與A、D類酶ΔdimCIM總體分布位置不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=108.887，P<0.05)。imCIM與EDPT的ROC曲線下面積分別為0.988(95% CI：0.977～0.999)和0.936(95% CI：0.909～0.963)。結(jié)論 imCIM是一種準(zhǔn)確、高效、便捷的碳青霉烯酶表型篩選方法，敏感性、特異性較高，適合用于流行病學(xué)監(jiān)測(cè)。

抑制劑增強(qiáng)改良碳青霉烯失活法；EDTA紙片增效試驗(yàn)；B類碳青霉烯酶；表型

近年來(lái)，碳青霉烯類抗生素的不合理使用導(dǎo)致產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的暴發(fā)[1]。碳青霉烯酶分為以絲氨酸為活性位點(diǎn)的A、D類酶和以金屬鋅離子為活性位點(diǎn)的B類酶。他唑巴坦、硼酸等可用于抑制A類碳青霉烯酶，EDTA、吡啶酸等可用于抑制B類碳青霉烯酶[2]。CLSI M100-S27中引入改良碳青霉烯失活法(modified carbapenemase inactivation method，mCIM)，該方法利用碳青霉烯酶能水解碳青霉烯類抗菌藥物的原理，將美羅培南與待測(cè)菌共同孵育，孵育過(guò)程中美羅培南被破壞失去活性，不能抑制大腸埃希菌ATCC 25922生長(zhǎng)[3]。本研究采用的抑制劑增強(qiáng)改良碳青霉烯失活法(inhibitor enhanced modified carbapenemase inactivation method，imCIM)通過(guò)引入EDTA以檢測(cè)B類碳青霉烯酶，同時(shí)與EDTA紙片增效試驗(yàn)(EDTA disc potentiation test，EDPT)對(duì)比分析，比較2種方法在檢測(cè)B類碳青霉烯酶中的差異。

1 材料和方法

1.1 菌株來(lái)源 收集河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院2014年1月至2016年8月臨床分離碳青霉烯類抗生素不敏感菌株181株，其中肺炎克雷伯菌44株、大腸埃希菌44株(亞胺培南或美羅培南MIC≥2 μg/mL)，鮑曼不動(dòng)桿菌43株、銅綠假單胞菌50株(亞胺培南或美羅培南MIC≥8 μg/mL)。同期收集碳青霉烯類抗生素敏感菌株83株，其中肺炎克雷伯菌25株、大腸埃希菌16株(亞胺培南和美羅培南MIC≤1 μg/mL)，鮑曼不動(dòng)桿菌25株、銅綠假單胞17株(亞胺培南和美羅培南MIC≤2 μg/mL)。以上菌株均為非重復(fù)分離菌株。所有受試菌株均由法國(guó)生物梅里埃Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀進(jìn)行鑒定和藥物敏感試驗(yàn)，并經(jīng)16S rDNA測(cè)序確認(rèn)[4]。質(zhì)控菌株：肺炎克雷伯菌ATCC BAA 1705、肺炎克雷伯菌ATCC BAA 2146、大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853均購(gòu)自美國(guó)MicroBiologics公司。

1.2 主要儀器與試劑 胰蛋白胨大豆肉湯(trypticase soy broth，TSB)培養(yǎng)基(溫州康泰生物公司)；EDTA、瓊脂糖(上海生工公司)；M-H瓊脂培養(yǎng)基(鄭州安圖生物公司)；美羅培南(10 μg)藥敏紙片(英國(guó)Oxoid公司)；Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀及配套GN、AST-GN09卡片(法國(guó)生物梅里埃公司)；PCR擴(kuò)增儀、2×Taq PCR Master Mix(美國(guó)ABI公司)；電泳儀(法國(guó)西比亞公司)；PCR引物由上海生工公司合成。

1.3 EDPT 配制0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝淮郎y(cè)菌菌懸液，均勻涂布于M-H瓊脂培養(yǎng)基，將2張10 μg美羅培南藥敏紙片置于其上，紙片間距不小于4 cm，其中一張紙片上加0.2 mol/L EDTA溶液10 μL，35 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，若2張紙片抑菌圈直徑之差(ΔdEDPT)≥5 mm則受試菌株產(chǎn)B類碳青霉烯酶[5]。以肺炎克雷伯菌ATCC BAA 1705、大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853作為陰性對(duì)照，以肺炎克雷伯菌ATCC BAA 2146作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 imCIM 從35 ℃培養(yǎng)24 h血平板上取滿1 μL接種環(huán)受試菌株，分別加入2管2 mL TSB中制成菌懸液，其中一管TSB含有0.1 mmol/L EDTA。將10 μg美羅培南藥敏紙片分別浸于上述菌懸液中，35 ℃溫育4 h。將0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝淮竽c埃希菌ATCC 25922菌懸液均勻涂布于M-H瓊脂培養(yǎng)基上并室溫放置3～10 min。將溫育后的美羅培南藥敏紙片取出，置于上述M-H瓊脂培養(yǎng)基上，紙片間距不小于4 cm，35 ℃溫育過(guò)夜觀察。若2張紙片抑菌圈直徑之差(ΔdimCIM)≥5 mm，即ΔdimCIM=d(MEM+EDTA)-d(MEM)≥5 mm則受試菌株產(chǎn)B類碳青霉烯酶。以肺炎克雷伯菌ATCC BAA 1705、大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853作為陰性對(duì)照，以肺炎克雷伯菌ATCC BAA 2146作為陽(yáng)性對(duì)照。以無(wú)菌水浸泡的美羅培南紙片作為空白對(duì)照。

1.5 PCR擴(kuò)增耐藥基因 按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取DNA并作為模板。參照文獻(xiàn)[6-7]合成A類碳青霉烯酶基因blaKPC、blaSME、blaGES、blaIMI，B類碳青霉烯酶基因blaNDM、blaVIM、blaIMP、blaSPM、blaGIM和D類碳青霉烯酶基因blaOXA-48、blaOXA-24、blaOXA-23，見(jiàn)表1，引物由上海生工公司合成。PCR擴(kuò)增體系50 μL：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，模板4 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各2 μL，滅菌ddH2O 17 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 60 s，Tm溫度下60 s，72 ℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。所得產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察，目的片段純化后由上海生工公司雙向測(cè)序，BLAST軟件與GenBank上已公布的基因序列進(jìn)行比對(duì)。

表1 耐藥基因引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 21.0軟件進(jìn)行。imCIM和EDPT分別與PCR行一致性檢驗(yàn)，以Kappa值≥0.75一致性較好；計(jì)量資料不服從正態(tài)分布，數(shù)據(jù)以中位數(shù)(25分位數(shù)，75分位數(shù))[M(P25，P75)]表示，采用Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)分析imCIM與EDPT檢測(cè)B類碳青霉烯酶的差異；采用獨(dú)立樣本 Kruskal-WallisH檢驗(yàn)對(duì)imCIM檢測(cè)A、B、D類碳青霉烯酶進(jìn)行比較；采用SigmaPlot 12.5軟件繪制ROC曲線，評(píng)估2種方法檢出B類碳青霉烯酶的能力，曲線下面積越大檢測(cè)能力越強(qiáng)。以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耐藥基因檢測(cè)及表型篩選結(jié)果 181株碳青霉烯類抗生素不敏感菌株中144株P(guān)CR擴(kuò)增耐藥基因陽(yáng)性，A、B、D類碳青霉烯酶分別為39株、77株、28株；83株碳青霉烯類抗生素敏感菌株P(guān)CR擴(kuò)增耐藥基因均為陰性。77株B類碳青霉烯酶基因陽(yáng)性菌株中，imCIM陽(yáng)性66株，陰性11株；EDPT陽(yáng)性51株，陰性26株。在187株B類碳青霉烯酶基因陰性的菌株中，imCIM陰性183株，陽(yáng)性4株；EDPT 陰性166株，陽(yáng)性21株。見(jiàn)表2。

表2 264株受試菌株基因型、MIC、imCIM和EDPT檢測(cè)結(jié)果

注：None，未檢出耐藥基因。

2.2 imCIM和EDPT結(jié)果分析 imCIM檢測(cè)B類碳青霉烯酶敏感性和特異性分別為85.71%(66/77)和97.86%(183/187)，與PCR結(jié)果的Kappa值0.859，一致性較好；EDPT檢測(cè)B類碳青霉烯酶敏感性和特異性分別為66.23%(51/77)和88.77%(166/187)，Kappa值0.561，一致性一般。

2.3 ΔdimCIM與ΔdEDPT的比較 用imCIM、EDPT分別檢測(cè)B類碳青霉烯酶，ΔdimCIM和ΔdEDPT分別為20(17,21) mm和12(4,14) mm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-6.941，P<0.05)；用imCIM檢測(cè)A、D類碳青霉烯酶，ΔdimCIM為0。A、B、D類碳青霉烯酶ΔdimCIM的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=108.887，P<0.05)，imCIM檢測(cè)B類酶ΔdimCIM水平與A、D類酶ΔdimCIM水平總體分布位置不同。

2.4 imCIM和EDPT的ROC曲線 建立ROC曲線評(píng)估imCIM、EDPT在檢測(cè)B類碳青霉烯酶中的價(jià)值，見(jiàn)圖1。結(jié)果表明2種方法檢測(cè)B類碳青霉烯酶的曲線下面積分別為0.988(95% CI：0.977～0.999)和0.936(95% CI：0.909～0.963)，以0.5作為參考界值，2種方法曲線下面積均大于界值，其中imCIM的曲線下面積較大。

圖1 imCIM和EDPT檢測(cè)B類碳青霉烯酶ROC曲線

3 討論

Yamda等[8]評(píng)估了改良Hodge試驗(yàn)(modified Hodge test，MHT)、Carba NP試驗(yàn)(Carba NP test，CNP)和碳青霉烯失活法(carbapenemase inactivation method，CIM)篩選產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌的能力，CIM比MHT和CNP表現(xiàn)出較高的敏感性和特異性，在一定程度上提高了NDM、OXA型碳青霉烯酶的檢出率。曹蕾等[9]和魏宏蓮等[10]采用CNP和CIM分別對(duì)腸桿菌科細(xì)菌和銅綠假單胞菌進(jìn)行碳青霉烯酶檢測(cè)，CIM操作簡(jiǎn)單、成本低廉、一致率高。mCIM在CIM的基礎(chǔ)上將藥敏紙片與受試菌株的溫育時(shí)間由2 h延長(zhǎng)至4 h，增強(qiáng)碳青霉烯酶對(duì)美羅培南的水解，確保產(chǎn)碳青霉烯酶菌株可被有效檢出。imCIM利用EDTA可抑制B類碳青霉烯酶的特性，干擾碳青霉烯酶水解美羅培南，使其在篩查碳青霉烯酶的同時(shí)可區(qū)分產(chǎn)酶表型。

本研究參考Yamada等[11]以ΔdimCIM≥5 mm作為imCIM的判讀標(biāo)準(zhǔn)，分別采用imCIM和EDPT檢測(cè)B類碳青霉烯酶，結(jié)果imCIM的敏感性、特異性高于EDPT，Kappa值>0.75，與PCR結(jié)果一致性較高。imCIM檢測(cè)A、B、D類碳青霉烯酶ΔdimCIM總體分布位置不同(P<0.05)，imCIM可有效篩選B類碳青霉烯酶。EDPT的ROC曲線下面積雖不及imCIM，但仍大于參考界值，其作為篩選產(chǎn)金屬酶菌株的傳統(tǒng)方法，步驟簡(jiǎn)單，操作性強(qiáng)，各級(jí)醫(yī)院均可開(kāi)展。imCIM基于穩(wěn)定性高、重復(fù)性好的特點(diǎn)，不易受操作人員等外界因素的影響，在溫育過(guò)程中使碳青霉烯酶與美羅培南、EDTA充分反應(yīng)，提高了B類碳青霉烯酶的檢出率，但關(guān)于imCIM的研究尚不完善，其操作步驟及判讀標(biāo)準(zhǔn)有待進(jìn)一步規(guī)范。

CLSI M100-S27中提出mCIM檢測(cè)KPC、NDM、VIM、IMP、IMI、SPM、SME和OXA型碳青霉烯酶的敏感性和特異性均>99%，目前尚無(wú)關(guān)于非腸桿菌科細(xì)菌和其他碳青霉烯酶的調(diào)查。本研究納入非發(fā)酵菌，包括43株鮑曼不動(dòng)桿菌和50株銅綠假單胞菌，imCIM的敏感性和特異性有所降低。結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有52株受試菌株imCIM、EDPT、PCR檢測(cè)結(jié)果不一致，其中1株攜帶blaIMP基因、3株攜帶blaVIM基因的銅綠假單胞菌和3株攜帶blaNDM基因的大腸埃希菌imCIM和EDPT結(jié)果均為陰性，可能由于受試菌株同時(shí)產(chǎn)其他A、D類碳青霉烯酶，使ΔdimCIM和ΔdEDPT<5 mm造成漏檢；3株攜帶blaOXA-23基因的鮑曼不動(dòng)桿菌imCIM和EDPT均為陽(yáng)性，可能由于本研究碳青霉烯酶基因檢測(cè)尚不全面，或是作為PCR擴(kuò)增模板的質(zhì)粒在提取過(guò)程中部分金屬酶基因丟失導(dǎo)致；8株攜帶blaNDM基因的大腸埃希菌和6株攜帶blaIMP基因、5株攜帶blaVIM基因的銅綠假單胞菌EDPT表現(xiàn)為陰性，可能由于受試菌株產(chǎn)酶量少，導(dǎo)致EDPT中EDTA抑制B類酶效果不明顯，使ΔdEDPT<5 mm，造成假陰性。此外，EDTA對(duì)B類碳青霉烯酶的抑制存在缺陷：(1)EDTA在一定程度上抑制受試菌株的生長(zhǎng)，或增強(qiáng)細(xì)菌膜的通透性導(dǎo)致抗生素敏感性增加，造成EDPT假陽(yáng)性[12-13]，本研究中4株攜帶blaOXA-23基因的鮑曼不動(dòng)桿菌EDPT陽(yáng)性可能與此有關(guān)；(2)EDTA存在對(duì)B類碳青霉烯酶抑制不穩(wěn)定的現(xiàn)象[14]，可能造成本研究中4株攜帶blaIMP基因的銅綠假單胞菌imCIM假陰性，1株攜帶blaKPC基因的肺炎克雷伯菌imCIM假陽(yáng)性；(3)EDTA對(duì)少量ESBL、KPC、OXA-48也具有抑制作用，可導(dǎo)致EDPT假陽(yáng)性[15]，可能與本研究中8株攜帶blaKPC基因的肺炎克雷伯菌、2株P(guān)CR擴(kuò)增碳青霉烯酶基因陰性的大腸埃希菌、4株P(guān)CR擴(kuò)增碳青霉烯酶基因陰性的銅綠假單胞菌EDPT陽(yáng)性有關(guān)。與EDTA相比，吡啶二羧酸特異性高。另外，本研究中15株鮑曼不動(dòng)桿菌、2株大腸埃希菌、4株銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥，但PCR結(jié)果均為陰性，可能由其他機(jī)制介導(dǎo)耐藥，如細(xì)菌高度表達(dá)ESBL或AmpC酶合并孔蛋白缺失或表達(dá)降低，主動(dòng)外排系統(tǒng)高表達(dá)，以及碳青霉烯類抗生素作用靶位點(diǎn)青霉素結(jié)合蛋白(penicillin binding protein，PBP)的改變或者攜帶其他本研究未檢測(cè)相關(guān)碳青霉烯酶基因。本課題組研究嘗試了用他唑巴坦酸及硼酸來(lái)檢測(cè)A類碳青霉烯酶，但敏感性較低，可能是由于他唑巴坦酸作為一種醫(yī)藥中間體，并不能很好地代替他唑巴坦作為酶抑制劑的功能，且他唑巴坦酸及硼酸的用量仍需進(jìn)一步研究。

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(本文編輯：周萬(wàn)青，劉群)

Effectiveness evaluation of imCIM for detection of class B carbapenemase

CHENGKuo,YUHong-wei,MAWei-li,HEJing,YANGZi-xuan,FENGJun-hua,ZHANGJin-yan

(DepartmentofClinicalLaboratory,TheFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,Hebei,China)

Objective To evaluate the application value of inhibitor enhanced modified carbapenemase inactivation method (imCIM) in the detection of class B carbapenemase. The differences between imCIM and EDTA disc potentiation test (EDPT) were comparatively analyzed. Methods A total of 181 strains of carbapenem insensitive strains were collected, among which there were 44 strains ofKlebsiellapneumoniae, 44 strains ofEscherichiacoli, 43 strains ofAcinetobacterbaumanniiand 50 strains ofPseudomonasaeruginosa. The 83 strains of carbapenem-sensitive strains were composed of 25 strains ofKlebsiellapneumoniae, 16 strains ofEscherichiacoli, 25 strains ofAcinetobacterbaumanniiand 17 strains ofPseudomonasaeruginosa. The class B carbapenemase in the 264 strains of pathogenic bacteria was screened by imCIM and EDPT, and PCR results were used as gold standard. The statistical analysis was performed with consistency check, related-sample Wilcoxon signed rank sum test, independent samples Kruskal-Wallis H test and ROC curve. Results Among the 181 strains of carbapenem insensitive strains, PCR results of 144 strains were positive for drug resistance gene. The samples of class A, B and D of carbapenemase were 39, 77 and 28 strains respectively. The results of imCIM showed that 70 strains were positive, and the other 111 strains were negative. The imCIM results of 166 strains were consistent with those of PCR. The results of EDPT showed that 72 strains were positive, and the other 109 strains were negative. The EDPT results of 134 strains were consistent with those of PCR. The results of PCR, EDPT and imCIM of 83 carbapenem sensitive strains were negative. The sensitivity and specificity of imCIM were 85.71% (66/77)and 97.86%(183/187), and the value of Kappa was 0.859. The sensitivity and specificity of EDPT were 66.23%(51/77) and 88.77%(166/187), and the value of Kappa was 0.561. The difference of inhibition zone of imCIM (ΔdimCIM) was different from EDPT(ΔdEDPT) and the difference was statistically significant (Z=-6.941，P<0.05). In the imCIM detection, the ΔdimCIMlevel of class B carbapenemase showed different population distribution position from class A and D carbapenemase with the statistically significant difference (χ2=108.887,P<0.05). The areas under the ROC curve of imCIM and EDPT were 0.988 (95%CI: 0.977 to 0.999) and 0.936 (95%CI: 0.909 to 0.963), respectively. Conclusion imCIM should be accurate, efficient and convenient for screening of carbapenem phenotype for its high sensitivity and specificity, and suitable for epidemiological monitoring.

inhibitor enhanced modified carbapenemase inactivation method; EDTA disc potentiation test; class B carbapenemase; phenotype

10.13602/j.cnki.jcls.2017.01.08

河北省衛(wèi)生廳重點(diǎn)科技研究計(jì)劃基金(20150332)。

程闊，1990年生，女，碩士研究生，研究方向：臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)。

張金艷，主任技師，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：jinyanzhang66@163.com。

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2016-11-01)