徐莉，崔大偉，戴玉柱，王磊，楊先知，謝國良，鄭書發(fā)，孫長貴，成軍，陳瑜

(1．浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗科，杭州 310003；2．浙江省臨床體外診斷技術(shù)研究重點實驗室，杭州 310003；3．中國人民解放軍第一一七醫(yī)院檢驗科，杭州 310013)

·研究生園地·

浙江省柯薩奇病毒A16VP1基因特征分析及B細胞抗原表位預(yù)測*

徐莉1,2,3，崔大偉1,2，戴玉柱3，王磊1,2,3，楊先知1,2，謝國良1,2，鄭書發(fā)1,2，孫長貴3，成軍3，陳瑜1,2

(1．浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗科，杭州 310003；2．浙江省臨床體外診斷技術(shù)研究重點實驗室，杭州 310003；3．中國人民解放軍第一一七醫(yī)院檢驗科，杭州 310013)

目的 了解浙江省柯薩奇病毒A16(CA16)VP1基因特征及其變遷規(guī)律并預(yù)測VP1蛋白上B細胞抗原表位。方法 在GenBank檢索并下載35個浙江省CA16流行株及69個已知基因型CA16參考株的VP1基因序列，使用MEGA 6.0軟件進行比對分析和構(gòu)建種系進化樹，確定浙江省CA16流行株的基因型，并分析VP1核苷酸和氨基酸同源性及氨基酸變異；運用DNA Star中的Protean模塊預(yù)測VP1上可能的線性B淋巴細胞抗原表位。結(jié)果 浙江省CA16病毒基因型為B1基因型(34株)和A基因型(1株)。B1型中以B1b亞型(24株)占絕對優(yōu)勢，其次為B1a亞型(10株)。浙江省CA16流行株VP1核苷酸和氨基酸同源性分別為75.5%～100%和89.5%～100%；VP1區(qū)氨基酸序列高度保守，但也存在部分變異。VP1中可能的B細胞抗原表位(氨基酸肽段)有13個，分別為10-20、30-38、57-62、73-79、98-106、118-123、159-168、173-177、184-189、240-246、265-273、274-284和289-295。結(jié)論 浙江省CA16流行株存在A、B1 2個基因型，B1b和B1a為主要基因型，其VP1區(qū)氨基酸變異程度較低，VP1中13個預(yù)測的B細胞抗原表位可為CA16疫苗的研制提供科學(xué)依據(jù)。

柯薩奇病毒A16；VP1；基因特征；氨基酸變異；B細胞抗原表位

柯薩奇病毒屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，共有30個血清型，包括A組病毒的24個血清型(A1～A24)和B組病毒的6個血清型(B1～B6)，其中柯薩奇病毒A16(Coxsaekievirus A16，CA16)是引起兒童手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)的主要病原體之一[1]。CA16感染除了引起輕癥感染外，還可導(dǎo)致重癥或死亡病例發(fā)生[2-3]。近年來浙江省HFMD發(fā)病率一直位居法定傳染病前兩位[4]，而且發(fā)病數(shù)一直處于全國前列，防控形勢不容樂觀。2008至2015年浙江省共報告HFMD 875 945例，重癥患者1 885 例，死亡111例，經(jīng)實驗室確證的HFMD中CA16占21.82%[5]，且呈逐年上升趨勢。病毒結(jié)構(gòu)蛋白1(viral protein 1, VP1)中包含主要的中和抗原決定簇和毒力相關(guān)位點，是分型的主要依據(jù)[6-8]。本文對浙江省CA16流行株VP1基因特征進行研究，旨在分子水平上為HFMD預(yù)防和CA16疫苗研制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 CA16VP1基因序列的獲取 從GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)檢索并下載浙江省CA16VP1基因序列，共35株，見表1。選取69個經(jīng)文獻[6,9]確定基因型且包含CA16各個基因型(亞型)的國內(nèi)外CA16VP1基因序列及1個腸道病毒71型(EV71)原型株(EV71BrCr，GenBank 序列號：U22521)的VP1區(qū)序列作為參比序列，見表2。

1.2 CA16VP1進化樹構(gòu)建和基因序列分析 采用MEGA 6.0軟件將下載的序列進行比對并截齊，EV71BrCr作為外群，用鄰接法(Neighbour-Jioning，N-J)構(gòu)建CA16VP1全基因系統(tǒng)進化樹，采用Bootstrap法(replication=1 000)進行檢驗，并分析浙江省CA16流行株和參考株間VP1基因和由其推導(dǎo)出的氨基酸序列同源性及氨基酸變異情況。

1.3 CA16 VP1結(jié)構(gòu)蛋白B淋巴細胞表位預(yù)測 用DNA Star軟件Protean模塊，采用Kyte-Oolittle、Karplus-Schultz、Emini和Jameson-Wolf對VP1蛋白氨基酸的親水性、柔韌性、表面可能性及抗原指數(shù)進行單參數(shù)分析。

2 結(jié)果

2.1 CA16VP1區(qū)同源性和系統(tǒng)進化分析 CA16VP1系統(tǒng)進化樹顯示,浙江CA16流行株及參考株分為 A和B 2個基因型，B基因型可分為B1和B2 2個亞型，B1型又可分為B1a、B1b和B1c 3個亞型。浙江省CA16流行株彼此間同源性為75.5%～100%，與CA16原型株(U05876)同源性為75.8%～99.3%，親緣關(guān)系較遠，分別處在A、B 2個基因型分支上，其中寧波株(JQ315094)分布于A型分支上，與安徽株(EU812514)同源性為99.8%；其他均屬于B1亞型，彼此間同源性為89%～100%，其中24株分布于B1b分支上，彼此間同源性為93.1%～100%，與B1b參考株同源性為92.3%～99.4%，與江蘇(KT327155)參考株親緣關(guān)系較近，同源性為94.4%～99.4%；10株分布于B1a分支上，彼此間同源性為94.4%～99.4%，與B1a參考株同源性為90.7%～99.1%，與安徽(KC755230)參考株親緣關(guān)系較近，同源性為96%～99.1%。見圖1。

表2 CA16各基因型參考序列信息[6, 8-15]

注：●，為疫苗候選株[8,10-14]；▲，為強毒株；▼，為弱毒株[15]。

注：●，浙江省CA16流行株；，CA16疫苗候選株[8, 10-14]。

圖1 CA16VP1全基因進化樹

2.2 CA16 VP1氨基酸序列同源性分析 浙江省CA16流行株與原型株(U05876)氨基酸同源性為90.9%～98.3%。浙江A型寧波株(JQ315094)與原型株(U05876)及安徽阜陽株(EU81251)氨基酸同源性分別為98.3%和99.6%，其他34株B型流行株氨基酸同源性為97.6%～100%，其中B1b亞型組內(nèi)氨基酸同源性為97.6%～100%，B1a亞型組內(nèi)氨基酸同源性為98.6%～100%。浙江省CA16流行株與疫苗候選株[8, 10-14](KF055238、JN590244、EU262658)VP1氨基酸同源性分別為90.2%～99.6%、90.5%～100%、90.5%～100%。

2.3 CA16各基因亞型VP1氨基酸變異分析 浙江CA16流行株與疫苗候選株(KF055238)相比，有多個氨基酸變異位點，絕大多數(shù)流行株均在第1位和285位氨基酸出現(xiàn)變異。B1b流行株氨基酸變異位點有10個，為G1W/R、N14S、L23M、Q48R、N108Y、L113F、M230V、R285K、T287S、T295P；B1a流行株有5個氨基酸變異位點，為 R1G/W、M7I、R18P、R285K、T240I；A流行株(JQ315094)與安徽阜陽株(EU81251)相比變異為C1G，與原型株(U05876)相比變異為C1G、Q101R、N102D、E145Q、P148S。2個疫苗候選株(EU262658和JN590244)VP1氨基酸序列完全一致，大部分浙江流行株VP1氨基酸序列與其相同，但也有幾個流行株出現(xiàn)氨基酸變異，變異表現(xiàn)為：W1G、M7I、N14S、R18P、L23M、Q48R、N108Y、L113F、M230V、T240I、T287S、T295P，而A型寧波株(JQ315094)與疫苗候選株(EU262658和JN590244)則出現(xiàn)多個變異位點，表現(xiàn)為W1G、T11A、N14S、Q101R、N102D、L119M、E145Q、P148S、E213A、L215P、A217S、L220A。見表3-5。

表3 浙江CA16 B1b 流行株VP1蛋白氨基酸變異情況

注：●，為疫苗候選株[8,10-14]；▲，為強毒株；▼，為弱毒株[15]；以疫苗候選株(KF055238)氨基酸序列為參比序列，序列相同的以“.”表示，若有變異則以相應(yīng)的氨基酸表示。

表4 浙江CA16 B1a流行株VP1蛋白氨基酸變異情況

注：●，為疫苗候選株[8,10-14]；▲，為強毒株；▼，為弱毒株[15]；以疫苗候選株(KF055238)氨基酸序列為參比序列，序列相同的以“.”表示，若有變異則以相應(yīng)的氨基酸表示。

表5 浙江CA16 A型流行株VP1蛋白氨基酸變異情況

注：●，為疫苗候選株[8,10-14]；▲，為強毒株；▼，為弱毒株[15]；*，為CA16 A型株；以疫苗候選株(KF055238)氨基酸序列為參比序列，序列相同的以“.”表示，若有變異則以相應(yīng)的氨基酸表示。

2.4 CA16 VP1結(jié)構(gòu)蛋白B淋巴細胞表位預(yù)測 挑選與其他株氨基酸同源性最高的寧波株(JQ315113)進行研究，用DNA Star中的Protean對其VP1氨基酸序列進行B淋巴細胞抗原表位預(yù)測。結(jié)合Gamier-Robson方法和Chou-Fasman方法預(yù)測發(fā)現(xiàn)VP1蛋白中存在豐富的β折疊，較多的β轉(zhuǎn)角，無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)較少，α螺旋區(qū)很少。根據(jù)DNA Star軟件Protean模塊對VP1蛋白的親水性、柔韌性、抗原性指數(shù)和表面可能性的預(yù)測結(jié)果，見圖2。 選取親水性高(指數(shù)≥0)、柔韌性好、可及性大(指數(shù)≥1)和抗原性強(指數(shù)≥0)的區(qū)域，同時參考VP1蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果，選取包含無規(guī)則卷曲和/或β轉(zhuǎn)角區(qū)域，VP1蛋白中獲得13個可能的B細胞抗原表位(氨基酸肽段)，分別為：10-20，30-38，57-62，73-79，98-106，118-123，159-168，173-177，184-189，240-246，265-273，274-284，289-295。見表6。

表6 CA16 VP1蛋白可能的B細胞抗原表位

圖2 CA16 VP1蛋白的親水性、柔韌性、抗原指數(shù)、表面可及性的預(yù)測結(jié)果

3 討論

本研究選用VP1基因序列進行系統(tǒng)進化分析，發(fā)現(xiàn)浙江CA16流行株VP1序列與其原型株相比發(fā)生了變化，已進化為A和B 2個基因型。浙江CA16流行株存在多個傳播鏈，主要為B1b和B1a 2個亞型，也有少數(shù)為A型，與中國整體CA16流行情況一致[6,16]，但與葛瓊等[17]報道的結(jié)果有所不同。2008年曾在安徽阜陽首次發(fā)現(xiàn)CA16 A型株(EU812514)，2010年在浙江省再次檢出CA16 A型寧波株(JQ315094)。浙江B1b和B1a流行株分別與江蘇株(KT327155)和安徽株(KC755230)親緣關(guān)系較近，說明浙江省CA16流行株已經(jīng)與鄰近省份的CA16流行株存在共同進化和循環(huán)。

CA16進化速率相對于EV71相對緩慢[9]，但作為RNA病毒，其本身的變異頻率不低。VP1中包含主要的中和抗原決定簇和毒力相關(guān)位點及大量宿主細胞受體結(jié)合位點[6-8, 13-14]，因此對CA16 VP1氨基酸序列變異的研究尤為重要。浙江省CA16流行株VP1氨基酸序列出現(xiàn)多個變異位點，各基因亞型變異情況有所不同。溫州CA16流行株均出現(xiàn)了L23M改變，其致病性和毒力可能發(fā)生改變，從而引起HFMD暴發(fā)。Shi等[18]曾在VP1上發(fā)現(xiàn)了6個高度保守的中和線性抗原表位，浙江省大部分CA16流行株在這些抗原表位上未見突變，但KC507895株出現(xiàn)G1W、Q48R、M230V、T287S變異，KP289415株變異表現(xiàn)為G1W、N14S、Q23M、N108Y、L113F，JQ315094株表現(xiàn)為Q101R、N102D、L119M、E213A、L215P、A217S、L220A變異，這些氨基酸變異是否直接影響病毒抗原性，有待進一步研究。有文獻報道VP1上存在多個與毒力和致病性相關(guān)的位點，這些位點發(fā)生變異(R51K、K52R、T98M、N102D、T103A、E145V、N218D、E241K、T248A和T/H295A)可使病毒毒力減弱，其中N102D和E241K氨基酸發(fā)生改變毒力明顯降低[6-8,13-14]。A型寧波株(JQ315094)在102和145位發(fā)生了氨基酸改變，寧波株(JQ315108)在295位發(fā)生了氨基酸改變，其他浙江流行株在以上幾個毒力位點未發(fā)現(xiàn)改變。推測近幾年浙江省由CA16引起HFMD的臨床癥狀較輕，可能與其致病性和毒力未發(fā)生較大改變有關(guān)。VP1第94-108位氨基酸肽段是一個保守型線性中和抗原表位，其發(fā)生N102D突變可以使該CTL抗原表位的親和力下降[13]，A型寧波流行株(JQ315094)在該抗原表位上發(fā)了N102D突變，屬于中性氨基酸突變?yōu)樗嵝园被?，其毒力和致病性減弱。浙江省CA16流行株與3個疫苗候選株(KF055238、JN590244、EU262658)[8,10-12]相比，有多個位點氨基酸發(fā)生變異，因此在選擇CA16疫苗株時，要考慮不同地區(qū)各基因型中氨基酸變異情況。

目前尚無針對CA16病毒的特效藥物，接種疫苗是控制該病毒最有效的手段，但CA16疫苗還處在臨床前研究階段[8,10-14]。中和表位確定是疫苗研制的重要基礎(chǔ)，而表位篩選是確定抗原表位的主要手段。本研究對GenBank上浙江省所有CA16病毒VP1基因序列進行比較，通過進化樹、同源性和氨基酸變異的分析，發(fā)現(xiàn)浙江省除A型寧波株外，其他34株流行株VP1氨基酸同源性在97.6%以上，提示浙江省CA16流行株VP1區(qū)高度保守，VP1的抗原性可能無明顯變化，這對疫苗研制十分重要。通過生物分析軟件成功預(yù)測了寧波株(JQ315100)VP1蛋白有13個潛在的B淋巴細胞抗原表位(氨酸肽段)，分別為：10-20、30-38、57-62、73-79、98-106、118-123、159-168、173-177、184-189、240-246、265-273、274-284和289-295。通過序列比對發(fā)現(xiàn)這些B淋巴細胞抗原表位在浙江省CA16不同基因亞型流行株高度保守，與石金平和高孟等[18-19]發(fā)現(xiàn)的VP1抗原表位有所不同。這些高度保守的CA16 B淋巴細胞抗原表位的發(fā)現(xiàn)為HFMD疫情防控和CA16疫苗研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。GenBank中浙江省CA16流行株VP1基因序列較少，本研究中浙江省35個CA16流行株僅來自杭州、寧波和溫州3個地方，尚存在著一定的局限性，提示我們在今后的HFMD防控工作中，應(yīng)進一步擴大研究范圍，加強對CA16病毒基因型及變異的監(jiān)測，以便做更全面準(zhǔn)確的分析。

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(本文編輯：周萬青，劉群)

Analysis for characteristics ofCoxsaekievirusA16VP1 gene and prediction of B lymphocyte antigen epitopes in Zhejiang province, China

XULi1,2,3,CUIDa-wei1,2,DAIYu-zhu3,WANGLei1,2,3,YANGXian-zhi1,2,XIEGuo-liang1,2,ZHENGShu-fa1,2,SUNChang-gui3,CHENGJun3,CHENYu1,2

(1.DepartmentofLaboratoryMedicine,theFirstAffiliatedHospital,CollegeofMedicine,ZhejiangUniversity,Hangzhou310003,Zhejiang; 2.KeyLaboratoryofClinicalinvitroDiagnosticTechniquesofZhejiangProvince,Hangzhou310003,Zhejiang; 3.DepartmentofLaboratoryMedicine,the117thHospitalofPLA,Hangzhou310013,Zhejiang,China)

Objective To understand the genetic characteristics and the variation pattern of theVP1 gene among the Coxsackievirus A16 (CA16) strains isolated in Zhejiang province, and predict the possible B lymphocyte antigen epitopes in the VP1 protein. Methods All theVP1 gene sequences of 35 CA16 strains isolated in Zhejiang and 69 genotyped reference strains were retrieved from GenBank. MEGA6.0 software was used to compare these sequences and constructed phylogenetic tree to determine the genotypes of the CA16 strains isolated in Zhejiang, and the analysis of homology consistency of nucleotide and mutation of amino acid were performed. DNA Star Protean module was used to predict the possible B lymphocyte antigen epitopes in the VP1 protein. Results There were 2 genotypes among the CA16 strains in Zhejiang province, i.e., B1 genotype (34 strains) and A genotype (1 strain). B1b subtype (24 strains) dominated in B1 genotype, followed by B1a subtype (10 strains). The homology consistency of nucleotide and amino acid of VP1among all the CA16 strains in Zhejiang were 75.5% to 100% and 89.5% to 100% respectively. The amino acid sequences of VP1 among the CA16 strains in Zhejiang were highly conserved, but there were also some variations among them. There were 13 possible B lymphocyte antigen epitopes (amino acid peptides) in the VP1 protein, i.e., 10-20, 30-38, 57-62, 73-79, 98-106, 118-123, 159-168, 173-177, 184-189, 240-246, 265-273, 274-284 and 289-295. Conclusion Two genotypes, A and B1, in CA16 strains were isolated in Zhejiang. B1b and B1a were the major subtypes. The amino acid mutation degree of VP1 protein of CA16 strains in Zhejiang was quite low. The prediction of 13 B lymphocyte antigen epitopes in the VP1 protein could provide scientific reference foundation for the development of the vaccine against CA16 strain.

CoxsaekievirusA16; VP1; genetic characteristics; amino acid variations; B lymphocyte antigen epitope

10.13602/j.cnki.jcls.2017.01.18

國家科技重大專項“傳染病監(jiān)測技術(shù)平臺”項目(2012ZX10004-210)。

徐莉，1987年生，女，碩士研究生，從事分子病毒學(xué)研究，E-mail：xuli1112@126.com。

陳瑜，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：chenyu-zy@163.com。

R512.5

A

2016-11-04)