劉 芳，劉永杰，包俊華，金 銳，白 剛，唐大偉，于辛酉

·論 著·

PRMT6、PEX10、SOX5和CYP19基因多態(tài)性與生精障礙相關(guān)性研究

劉 芳1，劉永杰1，包俊華1，金 銳1，白 剛1，唐大偉1，于辛酉2

目的 通過探討蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶 (PRMT6)、過氧化體生物合成因子10 (PEX10)、轉(zhuǎn)錄因子SOX5(SOX5)和芳香化酶19 (CYP19)基因位點(diǎn)多態(tài)性與精子生成障礙的相關(guān)性，進(jìn)一步為男性不育提供理論基礎(chǔ)。方法 選擇87例嚴(yán)重少弱精子癥患者、96例非梗阻無精癥患者，將健康查體者51例作為對(duì)照組。采集患者和健康對(duì)照者的外周血，提取全基因組DNA，采用Snapshot PCR技術(shù)對(duì)PRMT6(rs12097821)、PEX10(rs2477686)、SOX5(rs10842262)和CYP19(rs700518)基因位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行分析。結(jié)果 嚴(yán)重少弱精子癥、無精癥患者PRMT6(rs12097821)、PEX10(rs2477686)和SOX5(rs10842262)的各個(gè)基因型頻率和等位基因分布頻率與健康對(duì)照組相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而嚴(yán)重少弱精子癥、無精癥患者CYP19(rs700518)的基因型頻率和等位基因分布頻率與健康對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且攜帶G等位基因的基因型(AG+GG)可使嚴(yán)重少弱精子癥、非梗阻無精癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加1.646倍。結(jié)論 寧夏地區(qū)男性CYP19(rs700518)基因位點(diǎn)多態(tài)性與嚴(yán)重少弱精子癥、非梗阻無精癥具有一定的相關(guān)性，并且攜帶G等位基因的基因型(AG+GG)增加了嚴(yán)重少弱精子癥、非梗阻無精癥1.646(1.022～2.652)倍的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

生精障礙;單核苷酸多態(tài)性;男性不育

不孕不育是生殖健康領(lǐng)域存在的重大科學(xué)問題。不孕不育的原因有多種，其中男性不育約占全球不育案例的1/2，影響全球1/6的家庭[1]。生精障礙在不育男性占重要比例，除Y染色體缺失突變外，一些位于常染色體的基因突變也被報(bào)道與男性不育相關(guān)，因此精子生成障礙可能與遺傳因子改變以及環(huán)境污染物等密切相關(guān)。全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)發(fā)現(xiàn)，漢族人群中蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶 (PRMT6)、過氧化體生物合成因子10 (PEX10)、轉(zhuǎn)錄因子SOX5(SOX5)基因位點(diǎn)多態(tài)性與精子生成障礙有關(guān)[2-5]。有研究顯示，類固醇激素影響精子的形成和發(fā)育[6]。芳香化酶(cytochrome p450,CYP19) 是此過程的關(guān)鍵酶。因此，CYP19基因的多態(tài)性與嚴(yán)重少弱精子癥、非梗阻無精癥可能有關(guān)。在本研究中，利用Snapshot方法研究PRMT6(rs12097821)、PEX10(rs2477686)、SOX5(rs10842262)和CYP19(rs700518)基因多態(tài)性位點(diǎn)與寧夏地區(qū)男性嚴(yán)重少弱精子癥、非梗阻無精癥的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選擇2009年1月-2016年4月就診于銀川市婦幼保健院生殖中心男科門診的非梗阻性無精子癥和嚴(yán)重少弱精子癥患者為病例組，年齡23～37歲，平均(30.29±2.71)歲；不育年限1～9年，平均(3.58±2.44)。參照第5版WHO人類精液分析技術(shù)手冊(cè)選擇：非梗阻性無精子癥(NOA)患者均行≥2次精液離心檢查未見精子，并行睪丸組織病理檢查顯示睪丸生精功能阻滯或唯支持細(xì)胞綜合征后診斷為NOA。嚴(yán)重少弱精子癥(SO)患者為≥2次精液分析提示精子濃度<5×106/mL,活力低于50%，染色體核型分析和AZF檢測無異常。選擇同期有正常生育史、身體健康、無生殖道疾病的男性作為對(duì)照組，年齡24～40歲，平均(31.89±2.67)歲。所有研究對(duì)象之間均無親緣關(guān)系。本研究所有入選對(duì)象均知情同意。

采集所有研究對(duì)象的外周靜脈血3～4 mL，置于5 mL的EDTA抗凝管中，-80 ℃保存待檢。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取及檢測：按照Axygen公司血液DNA提取試劑盒產(chǎn)品說明書要求進(jìn)行操作。DNA提取完成后1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，濃度檢測后，皆標(biāo)準(zhǔn)化至10～17 ng/μl，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增引物及Snapshot PCR延伸引物的設(shè)計(jì)：設(shè)計(jì)PCR引物，引物由上海祥音生物公司合成，見表1-表2。

表1 PCR引物序列

表2 Snapshot PCR引物序列

1.2.3 PCR擴(kuò)增條件及Snapshot PCR擴(kuò)增條件：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；60 ℃，30 s，72 ℃，1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃，5 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用SAP及Exol酶進(jìn)行純化：37 ℃，60 min；75 ℃，15 min，4 ℃保存。Snapshot PCR擴(kuò)增條件：96 ℃，5 min，96 ℃，30 s；50 ℃，30 s，60 ℃，30 s，共25個(gè)循環(huán)；60 ℃，8 min，4 ℃保存。

1.2.4 多態(tài)性位點(diǎn)基因型判斷Snapshot PCR產(chǎn)物用SAP酶純化：37 ℃，60 min；75 ℃，15 min，4 ℃保存。純化后產(chǎn)物，使用ABI 3730XL儀器進(jìn)行多態(tài)性位點(diǎn)檢測，判斷基因型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)3組樣本的PRMT6(rs12097821)、PEX10(rs2477686)、SOX(rs10842262)和CYP19(rs700518)基因頻率進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)。對(duì)3組樣本PRMT6(rs12097821)、PEX10(rs2477686)、SOX5(rs10842262)和CYP19(rs700518)的等位基因分布頻率比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)算比值比(odds ratio，OR)及95%可信區(qū)間(confidence interval，CI),以分析PRMT6(rs12097821)、PEX10(rs2477686)、SOX5(rs10842262)和CYP19(rs700518)基因多態(tài)性位點(diǎn)與嚴(yán)重少弱精子癥患者、非梗阻無精癥的風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系。

2 結(jié)果

嚴(yán)重少弱精子癥患者、非梗阻無精癥PRMT6(rs12097821)、PEX10(rs2477686)、SOX5(rs10842262)、CYP19(rs700518)的基因型頻率和基因頻率符合Hardy-Weinberg平衡定律。

嚴(yán)重少弱精組和非梗阻無精組的PRMT6(rs12097821)基因型頻率及等位基因頻率與正常對(duì)照組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.227，P>0.05；χ2=1.707，P>0.05)；嚴(yán)重少弱精組與非梗阻無精組的PEX10(rs2477686)基因型頻率及等位基因頻率與正常對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；嚴(yán)重少弱精組與非梗阻無精組的SOX5(rs10842262)基因型頻率及等位基因頻率與正常對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.790，P>0.05；χ2=2.923，P>0.05)。

嚴(yán)重少弱精與非梗阻性無精組的CYP19(rs700518)基因型頻率及等位基因頻率與正常對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.529，P<0.05；χ2=8.274，P<0.05)，且與野生型(AA)相比，攜帶G等位基因的基因型(AG+GG)可使嚴(yán)重少弱精、非梗阻無精癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加1.646倍，95%CI為1.022～2.652，見表3。

表3 嚴(yán)重弱精少精組、非梗阻性無精組和正常對(duì)照組各基因的等位基因和基因型分布比較[n(%)]

3 討論

此次研究中，我們發(fā)現(xiàn)CYP19(rs700518)與寧夏地區(qū)男性生精障礙有顯著相關(guān)性，CYP19(rs700518) 基因多態(tài)性位點(diǎn)攜帶G等位基因的基因型(AG+GG)可使嚴(yán)重少弱精癥、非梗阻性無精癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加1.646倍，95%CI為1.022～2.652。CYP19基因編碼產(chǎn)生芳香化酶，該酶是雄激素合成雌激素過程中的關(guān)鍵酶，其異常表達(dá)將會(huì)影響體內(nèi)激素的正常水平，進(jìn)而影響男性生育功能[7]。雖然CYP19(rs700518)是氨基酸并沒有發(fā)生變化的同義突變，但它會(huì)影響轉(zhuǎn)錄后修飾，導(dǎo)致基因表達(dá)變化和芳香化酶水平，影響體內(nèi)激素水平。由單一的研究表明，芳香化酶轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺內(nèi)及睪丸內(nèi)芳香化酶會(huì)過量表達(dá)[8]，引起ERa的上調(diào)，影響輸精管、支持細(xì)胞和生精小管的管周細(xì)胞的活性[9]。由此可見，CYP19基因的表達(dá)在分子水平影響內(nèi)分泌的平衡，從而調(diào)控睪丸精子的生成，但是我們?nèi)孕枰敿?xì)的證據(jù)來證明CYP19(rs700518)在生精障礙病理中的作用。

此次研究結(jié)果顯示，PRMT6(rs12097821)、PEX10(rs2477686)、SOX(rs10842262)基因位點(diǎn)多態(tài)性與寧夏地區(qū)男性生精障礙未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性，但我們并不能否認(rèn)這些基因在精子生成中的作用。四川大學(xué)華西醫(yī)院GWAS研究發(fā)現(xiàn)，PRMT6(rs12097821)、PEX10(rs2477686)、SOX(rs10842262)基因位點(diǎn)多態(tài)性與生精障礙無相關(guān)性，而且PRMT6(rs12097821)突變個(gè)體精子數(shù)目竟高于非突變個(gè)體[10]。另一GWAS結(jié)果分析表明，PRMT6(rs12097821)、PEX10(rs2477686) 基因位點(diǎn)多態(tài)性與生精障礙無相關(guān)性，而SOX(rs10842262)基因位點(diǎn)多態(tài)性與生精障礙有顯著相關(guān)性[11]。故而PRMT6(rs12097821)、PEX10(rs2477686)、SOX(rs10842262)基因位點(diǎn)多態(tài)性與生精障礙的關(guān)系復(fù)雜，還需繼續(xù)擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究；CYP19(rs700518)基因位點(diǎn)多態(tài)性與寧夏地區(qū)男性生精障礙易感性有關(guān)，為男性不育癥的預(yù)防和內(nèi)分泌治療提供新的思路。

[1] Hirsh A.Male subfertility[J].BMJ，2003，327(7416):669-672.

[2] Bashamboo A.Human male infertility associated with mutations in NR5A1 encoding steroidogenic factor [J].Am J Hum Genet，2010，87(4):505-512.

[3] Okada H.Genome-wide expression of azoospermia testes demonstrates a specific profile and implicates ART3 in genetic susceptibility[J].PLoS Genet，2008，4(2):26.

[4] El Inati E.Autosomal mutations and human spermatogenic failure[J].Biochim Biophys Acta，2012，1822(12):1873-1879.

[5] Hu Z.A genome-wide association study in Chinese men identifies three risk loci for non-obstructive azoospermia[J].Nat Genet，2012，44(2):183-186.

[6] Saez JM.Leydig cells:endocrine，paracrine，and autocrine regulation[J].Endocr Rev，1994，15(5):574-626.

[7] Toda K，Shizuta Y.Molecular cloning of a cDNA showing alternative splicing of the 5′-untranslated sequence of mRNA for human aromatase P -450[J].European Journal of Biochemistry，1993，213(1):383-389.

[8] 張希牧，李軍，田永路，等.芳香化酶在人類乳腺癌、睪丸癌發(fā)生過程中的作用[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2009，6:62-63.

[9] 王剛，谷守義，陳康寧，等.精子發(fā)生阻滯不育患者睪丸雌激素受體α的表達(dá)[J].中華男科學(xué)雜志，2011，1:27-31.

[10] Tu W，Liu Y，Shen Y，et al.Genome-wide loci linked to non-obstructive azoospermia susceptibility may be independent of reduced sperm production in males with normozoospermia1[J].Biology of Reproduction，2015，92(2) ：254.

[11] Zou S，Li Z，Wang Y，et al.Association study between polymorphisms of PRMT6，PEX10，SOX5 and nonobstructive azoospermia in the Han Chinese population[J].Biology of Reproduction，2014，90(5)：470-479.

Relationship between PRMT6,PEX10,SOX5,CYP19 Gene Polymorphism and Dyszoospermia

LIUFang1,LIUYongjie1,BAOJunhua1,JINRui1,BAIGuang1,TANGDawei1,YUXinyou2.

1.YinchuanWomenandChildrenHealthCareHospital,Yinchuan750001,China;2.DepartmentofMedicalExperimentalCenter,GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,ChinaCorrespondingauthor:YUXinyou,Email: yxy＿nxmc@163.com

Objective To explore the correlation between Protein arginine N-methyltransferase 6 (PRMT6),Peroxisome biogenesis factor 10 (PEX10),SRY-related HMG-box 5 (SOX5) and cytochrome P450 (CYP19) gene polumorphisms and the disorder of sperm production,the theoretical basis of male sterility is further provided.Methods 87 patients with severe oliogozoospermia and 96 cases of non-obstructive azoospermia were selected,and 51 healthy subjects were selected as control group simutaneously.Collected the peripheral blood of patients and healthy controls,extracted the genomic DNA, and analysed PRMT6(rs12097821),PEX10(rs2477686),SOX5(rs10842262) and CYP19(rs7005118) gene polumorphisms by Snapshot PCR.Results Compared with the healthy control group,the PRMT6(rs12097821),PEX10(rs2477686) and SOX5(rs10842262) each genotype frequency and allele frequency of the patients with severe oliogozoospermia and non-obstructive azoospermia had no statistical significance(P>0.05),but CYP19(rs7005118) genotype frequency and allele frequency was statistical significant(P<0.05).And the genotype G allele (AG+GG) can make the risk of severe oliogozoospermia and non-obstructive azoospermia increased 1.646 times.Conclusion The CYP19(rs7005118) gene polymorphism of the Ningxia male is associated with severe oliogozoospermia and non-obstructive azoospermia,and the genotype G allele (AG+GG) increases the risk of severe oliogozoospermia and non-obstructive azoospermia 1.646 times.

Spermatogenesisdisorder；SNP；Malesterility

寧夏自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NZ1424；8NZ14135)

1.寧夏銀川市婦幼保健院生殖中心，寧夏 銀川 7500012.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，寧夏 銀川 750004

劉芳(1980-)，女，山東籍，主治醫(yī)師，碩士研究生，從事人類輔助生殖醫(yī)學(xué)臨床工作。

于辛酉，Email:yxy＿nxmc@163.com

http://www.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170215.1139.008.html

10.13621/j.1001-5949.2017.02.0097

R698.2

A

2016-10-25 [責(zé)任編輯]李 潔