宋佳卉 牛 楠 朱明星 佟雪琪 趙殷奇 徐士梅 宋 熔 趙 巍

(寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004)

缺氧對(duì)大鼠心肌細(xì)胞損傷的影響及機(jī)制

宋佳卉 牛 楠1朱明星1佟雪琪2趙殷奇1徐士梅 宋 熔3趙 巍1

(寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004)

目的 探討缺氧對(duì)大鼠心肌細(xì)胞系H9C2的損傷及機(jī)制。方法 在1%O2+5%CO2+94%N2條件下培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞株H9C2 3、6、12、24、48 h，并以正常大鼠心肌細(xì)胞株作對(duì)照，使用臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率；實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)心肌細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)；透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)；活性氧檢測(cè)試劑盒檢測(cè)胞內(nèi)活性氧(ROS)；Western印跡法檢測(cè)線粒體色素C蛋白表達(dá)水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞壞死程度。結(jié)果 缺氧狀態(tài)下，隨著缺氧時(shí)間的不斷增加,大鼠心肌細(xì)胞株H9C2的細(xì)胞生長(zhǎng)、存活率均明顯降低、細(xì)胞形態(tài)明顯改變，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)明顯損傷，ROS水平升高，線粒體細(xì)胞色素釋放增加，細(xì)胞凋亡率明顯增加，LDH的釋放率明顯增高。結(jié)論 缺氧會(huì)造成大鼠心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)速度減慢、形態(tài)改變及心肌線粒體損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死。

缺氧；線粒體損傷；凋亡；壞死

心肌梗死的發(fā)病率和死亡率均居于心血管疾病的首位〔1〕。心肌梗死是冠狀動(dòng)脈閉塞、血流中斷，使部分心肌因嚴(yán)重的持久性缺血從而發(fā)生局部壞死。而冠狀動(dòng)脈閉塞必然導(dǎo)致心肌細(xì)胞缺氧，所以氧氣是重要的病理生理調(diào)節(jié)因素，心臟的功能活動(dòng)是否正常取決于心肌細(xì)胞是否獲得足夠的氧氣，而心肌細(xì)胞較其他類型細(xì)胞對(duì)缺氧更敏感〔2〕。心肌缺氧能夠?qū)е滦募〖?xì)胞損傷，從而引發(fā)各類心臟疾病。因此，如何糾正缺氧對(duì)心肌細(xì)胞造成的損傷，這可能是治療、緩解各種心臟類疾病的研究方向〔3,4〕。本研究以缺氧為基本條件，探究細(xì)胞在缺氧環(huán)境中生長(zhǎng)、形態(tài)的損傷程度以及相關(guān)機(jī)制，為藥物治療及生物技術(shù)治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠心肌細(xì)胞H9C2(上海中科院細(xì)胞庫(kù))。DMEM高糖培養(yǎng)基(Thermo公司)、胎牛血清(Sigma公司)、臺(tái)盼藍(lán)(北京中生瑞泰科技有限公司)、0.25%胰酶(美國(guó)Hyclone公司)、CCK-8細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(貝博公司)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(南京建成生物工程研究所)、Annexin V-APC(伯樂(lè)公司)、7-AAD(伯樂(lè)公司)、細(xì)胞色素C單克隆抗體(兔抗大鼠，Abcam公司)、山羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)抗體(中杉金橋)、細(xì)胞線粒體分離試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)。三氣培養(yǎng)箱(Thermo公司)、CellAsic Onix(德國(guó) Merck)、透射電鏡(日立H7650)、流式細(xì)胞儀(BD Accuri C6)等。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞計(jì)數(shù) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的大鼠心肌細(xì)胞H9C2，胰酶消化，計(jì)數(shù)，將細(xì)胞按照相同的細(xì)胞數(shù)2×105個(gè)/ml接種在兩塊96孔板上，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)過(guò)夜，將一組細(xì)胞取出，放置在5%CO2+1%O2+94%N2的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3、6、12、24、48 h，另一組正常培養(yǎng)3、6、12、24、48 h，然后使用臺(tái)盼藍(lán)染色并計(jì)數(shù)兩組細(xì)胞數(shù),繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.2 細(xì)胞活力的檢測(cè) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的大鼠心肌細(xì)胞H9C2，待其融合度為80%左右時(shí)，使用胰酶消化，計(jì)數(shù)細(xì)胞后密度為2×105個(gè)/ml。加細(xì)胞懸液于96孔板中(每孔100 μl)，每組設(shè)置5個(gè)孔，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜；第2天，將一組細(xì)胞取出，放置在1%O2缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，另一組正常培養(yǎng)，缺氧培養(yǎng)至1.5 h后，兩組細(xì)胞每孔加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)缺氧培養(yǎng)1.5 h，共缺氧培養(yǎng)3 h后，取出96孔板，避光，測(cè)定450 nm各孔的吸光值。缺氧6、12、24、48 h 細(xì)胞活力的檢測(cè)也如上述步驟。細(xì)胞活力的計(jì)算：細(xì)胞活力=(缺氧細(xì)胞OD-空白OD)/(正常細(xì)胞OD-空白OD)×100%。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)變化的檢測(cè) 利用CellAsic實(shí)時(shí)細(xì)胞檢測(cè)儀，將儀器配套細(xì)胞板(M04S)進(jìn)行前處理，5%CO2、95%空氣、37℃。每孔導(dǎo)入細(xì)胞2×105個(gè)/ml，12 h貼壁后,5%CO2、5%空氣、90%N2、37℃開(kāi)始缺氧。6、12、24、48 h同一觀測(cè)地點(diǎn)，10×放大倍數(shù)，分別拍攝形態(tài)圖。

1.2.4 透射電鏡觀察 收集正常培養(yǎng)細(xì)胞和缺氧培養(yǎng)24 h的細(xì)胞，分別用2%戊二醛固定,1%鋨酸固定1 h,洗滌后丙醛脫水,環(huán)氧樹(shù)脂包埋，切片。使用透射電子顯微鏡觀察并攝片。

1.2.5 細(xì)胞活性氧(ROS)檢測(cè) 取6孔板中正常培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞與缺氧24 h的細(xì)胞，更換新培養(yǎng)基后每孔加入1 μl DCFH-DA，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育50 min后消化，無(wú)血清培養(yǎng)基重懸。利用流式細(xì)胞儀488 nm激發(fā)和525 nm發(fā)射檢測(cè)平均熒光強(qiáng)度代表ROS量。

1.2.6 Western印跡檢測(cè)胞漿細(xì)胞色素C蛋白的表達(dá)水平 取大鼠心肌細(xì)胞H9C2正常培養(yǎng)與缺氧24 h后，使用線粒體分離試劑盒分離出線粒體蛋白。BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，每孔以50 μg樣品上樣，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳。PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗(細(xì)胞色素C)4℃孵育過(guò)夜，二抗37℃孵育1 h，ECL化學(xué)顯色,Image Lab軟件進(jìn)行分析。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 使用7-AAD及Annexin V-APC對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，首先取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，胰酶消化后，計(jì)數(shù)2×106個(gè)/ml接種于兩塊6孔板中，置37℃，5%CO2培

養(yǎng)箱中過(guò)夜；其中一塊板放入三氣培養(yǎng)箱缺氧培養(yǎng)24 h，胰酶消化收集細(xì)胞，用含有2% BSA的PBS洗滌細(xì)胞2次，收集細(xì)胞后，加入500 μl的上樣緩沖液重懸，然后加入5 μl AnnexinV-APC冰浴10 min，加入1 μl 7-AAD冰浴10 min后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。

1.2.8 壞死細(xì)胞檢測(cè) 使用LDH試劑盒并按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，用于大鼠心肌細(xì)胞壞死的檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 使用臺(tái)盼藍(lán)染色法對(duì)不同時(shí)間段的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù) 與正常培養(yǎng)的細(xì)胞相比，缺氧后細(xì)胞數(shù)量均明顯降低。而隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，缺氧3、6、12、24、48 h后細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。見(jiàn)表1。

2.2 細(xì)胞形態(tài)檢測(cè) 經(jīng)CellAisc實(shí)時(shí)觀察，正常氧氣濃度培養(yǎng)的心肌細(xì)胞全部貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞核突出明顯，貼壁后細(xì)胞為菱形、梭形或多角形，伸出偽足，形成不規(guī)則的星形并形成放射狀排列的細(xì)胞簇。開(kāi)始缺氧6 h后心肌細(xì)胞活力開(kāi)始下降，搏動(dòng)次數(shù)減少，心肌細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始發(fā)生改變，細(xì)胞簇周圍有部分脫落，使細(xì)胞單層由橢圓形變成梭形，缺氧12 h后形態(tài)發(fā)生很大變化，心肌細(xì)胞的胞質(zhì)出現(xiàn)空泡和粗大顆粒樣物質(zhì)，細(xì)胞皺縮、脫落,見(jiàn)圖1。

表1 臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)±s，OD值)

與正常培養(yǎng)組比較:1)P<0.01

圖1 利用CellAsic觀測(cè)缺氧狀態(tài)下的大鼠心肌細(xì)胞(×10)

2.3 透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 正常對(duì)照組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常,核結(jié)構(gòu)正常，線粒體結(jié)構(gòu)清晰。缺氧組可見(jiàn)心肌細(xì)胞線粒體排列紊亂、腫脹,空泡或囊泡化,細(xì)胞核形狀不規(guī)則,核膜溶解個(gè)被地方甚至消失。外膜不完整,少部分線粒體損傷嚴(yán)重,破裂,溶解,見(jiàn)圖2。

2.4 ROS檢測(cè)結(jié)果 缺氧24 h處理能顯著提高細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，熒光強(qiáng)度也顯著增加(P<0.01)。正常培養(yǎng)組與缺氧24 h組中細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)水平分別為0.90±0.20，7.73±1.25，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

2.5 Western印跡檢測(cè)細(xì)胞色素C蛋白的表達(dá)水平 正常培養(yǎng)組與缺氧24 h組中細(xì)胞色素C表達(dá)水平分別為0.48±0.20和1.41±0.30；與正常組比較，缺氧24 h組細(xì)胞色素C蛋白的表達(dá)水平升高了1.94倍(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖2 透射電鏡顯示的心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化(×25 000)

圖3 正常培養(yǎng)組與缺氧24 h組細(xì)胞色素C表達(dá)水平

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果 正常培養(yǎng)組與缺氧24 h組中細(xì)胞凋亡水平分別為0.27±0.02和0.53±0.03，與正常培養(yǎng)組比較，缺血24 h組升高了0.97倍(P<0.05)。

2.7 LDH檢測(cè)結(jié)果 與正常培養(yǎng)組相比(0 h：6.23±3.12，3 h：6.58±3.21，6 h：6.64±0.54，12 h：7.43±2.89，24 h：5.31±4.36，48 h：11.43±2.83)，缺氧組的LDH水平(0 h：6.23±3.12，3 h：12.57±0.78，6 h：16.03±2.19,12 h：37.87±7.42,24 h：44.57±3.03,48 h:46.84±6.82)明顯上升(P<0.01)。

3 討 論

缺氧能夠造成心肌細(xì)胞損傷，最終導(dǎo)致心臟疾病加重。因此，如何抵御缺氧對(duì)心肌細(xì)胞造成的損傷是延緩心臟病發(fā)生發(fā)展的有效途徑。目前研究表明，缺氧可影響細(xì)胞的存活及生長(zhǎng)〔5〕，對(duì)于缺氧造成的細(xì)胞凋亡及細(xì)胞損傷的機(jī)制也進(jìn)行了相關(guān)的分析〔6,7〕，但這些研究并不系統(tǒng)全面。缺氧會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)減慢〔8〕，活力降低。本研究結(jié)果也說(shuō)明缺氧造成細(xì)胞活力降低可能會(huì)引起細(xì)胞死亡。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)隨著缺氧6 h開(kāi)始心肌細(xì)胞形態(tài)明顯受損，直至缺氧48 h完全失去細(xì)胞形態(tài)而死亡。通過(guò)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、活力以及形態(tài)的觀察，同時(shí)考慮到時(shí)間和細(xì)胞受損程度，該實(shí)驗(yàn)選擇24 h作為最佳缺氧時(shí)間點(diǎn)。超微病理改變是反映細(xì)胞損傷最直觀、最有效的指標(biāo)〔9,10〕。結(jié)果顯示，缺氧狀態(tài)對(duì)大鼠心肌細(xì)胞的細(xì)胞膜、核膜尤其是線粒體可以造成明顯損傷。線粒體是心肌細(xì)胞中最主要、含量最多的細(xì)胞器，也是產(chǎn)生ROS的重要場(chǎng)所。心肌缺氧過(guò)程中，在缺氧的作用下氧化應(yīng)激平衡失調(diào)，心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)產(chǎn)生大量ROS，導(dǎo)致線粒體膜和細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化、線粒體DNA損傷及細(xì)胞凋亡啟動(dòng)〔11〕。因此，線粒體ROS過(guò)表達(dá)是缺氧損傷機(jī)制中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。本研究提示缺氧可能造成了線粒體的損傷。而線粒體在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著樞紐作用〔12〕，在細(xì)胞受到刺激凋亡時(shí)線粒體釋放細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子，從而激發(fā)下游的凋亡執(zhí)行者，在凋亡中線粒體的作用是相當(dāng)重要的，也比較復(fù)雜，是近年來(lái)科研的熱點(diǎn)。線粒體釋放的細(xì)胞色素C是重要的凋亡誘導(dǎo)分子〔13〕。本實(shí)驗(yàn)利用Western印跡方法和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)缺氧24 h細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)線粒體釋放的細(xì)胞色素C大量增加，細(xì)胞凋亡率也明顯增加。說(shuō)明可能是缺氧造成的線粒體損傷從而引發(fā)細(xì)胞凋亡〔14〕。有文獻(xiàn)表明，缺氧可抑制大鼠心肌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡，凋亡程度隨缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)而加重，隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)死亡細(xì)胞逐漸增多〔15〕。細(xì)胞死亡的方式又分為細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死。對(duì)細(xì)胞壞死，目前普遍的檢測(cè)手段是LDH檢測(cè)。LDH是機(jī)體能量代謝中的一種重要酶，LDH漏出量多少可反映細(xì)胞膜的損傷，其外漏程度可間接反映缺氧受損程度〔16〕，細(xì)胞損傷后，胞內(nèi)LDH大量漏出，從上清液中LDH的含量可反映細(xì)胞的損傷程度〔17,18〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，缺氧狀態(tài)下造成大鼠心肌細(xì)胞中LDH的釋放量明顯增加，細(xì)胞死亡率顯著上升。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明大鼠缺氧狀態(tài)下會(huì)造成心肌細(xì)胞生長(zhǎng)減慢、活力降低、形態(tài)改變、線粒體損傷和細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞壞死，為深入研究損傷機(jī)制和尋求損傷后的保護(hù)措施奠定了基礎(chǔ)，為臨床治療提供參考依據(jù)。

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〔2016-10-27修回〕

(編輯 李相軍)

The mechanism of hypoxia on rat myocardial cell damage

SONG Jia-Hui，NIU Nan,ZHU Ming-Xing,etal.

Basic Medical College of Ningxia Medical University，Yinchuan 750004, Ningxia, China

Objective To investigate the damage and the mechanism of hypoxia on rat cardiomyocytes H9C2 of rats.Methods The cardiac muscle cell line H9C2 of rats was cultured under the conditions of 1%O2, 5%CO2, 94%N2and keeping for 3,6,12,24, 48 h.The cell count and the cell growth curves were plotted using the Trypan Blue,the cell survive rate was detected by CCK-8 assay. The degree of cell necrosis was detected by lactate dehydrogenase (LDH) kit, the flow cytometry was used to detect the apoptosis rate, mitochondrial cytochrome C was detected by Western blot, the reactive oxygen was tested by reactive oxygen assay kit, the intracellular structure was observed by TEM.Results Under the condition of hypoxic, while the time of hypoxia increasing, the cell growth and survival rate were significantly decreased, cell morphology had been changed significantly, the release rate of LDH was obviously increased, the apoptosis rate was clearly increased, the cytochrome enzymes was increased, the levels of reactive oxygen species were elevated, cell structure was damaged apparently.Conclusions Hypoxia could change the myocardial cell morphological, slow down the rate of cell growth, causing the cell necrosis or apoptosis and damaging the myocardial mitochondrial.

Hypoxia; Mitochondrial damage; Apoptosis; Necrosis

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助(81360042)

宋 熔(1971-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事心力衰竭發(fā)病機(jī)制與防治研究。 趙 巍(1960-)，男，教授，主要從事分子遺傳研究。

宋佳卉(1991-)，女，在讀碩士，主要從事分子遺傳學(xué)研究。

R34

A

1005-9202(2017)05-1044-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.002

1 寧夏醫(yī)科大學(xué)科技中心 2 寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院

3 中國(guó)人民解放軍第五醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科