張 倩

(鞍山市千山區(qū)動(dòng)物疫病控制中心,遼寧鞍山 114001)

遼寧絨山羊精液冷凍稀釋液的配方篩選

張 倩

(鞍山市千山區(qū)動(dòng)物疫病控制中心,遼寧鞍山 114001)

為了使遼寧絨山羊精液在冷凍保存時(shí)具有更好的活性，本實(shí)驗(yàn)采用一步稀釋法，通過檢測精子活率、質(zhì)膜完整性、線粒體活性、頂體完整率評價(jià)精液品質(zhì)的方法比較六種冷凍稀釋液。篩選出了適合遼寧絨山羊精液冷凍的最佳基礎(chǔ)冷凍稀釋液配方（100ml）：Tris 3.44g，檸檬酸1.83g，果糖1.26g，卵黃15%，甘油5%。

遼寧絨山羊 精液 冷凍稀釋液 配方篩選

遼寧絨山羊主要分布在遼寧東部山區(qū)以及遼東半島地區(qū)，具有體格大、抗逆性強(qiáng)、產(chǎn)絨量高、絨纖維細(xì)長、絨毛比例高、絨毛潔白、手感柔軟等優(yōu)良品質(zhì)。羊精液的冷凍保存不僅能提高種公羊的利用率，而且能降低繁殖成本，對人工授精技術(shù)的推廣應(yīng)用，對養(yǎng)羊生產(chǎn)的發(fā)展都產(chǎn)生了巨大的推動(dòng)作用。但是，山羊精液在凍前和凍后損傷較大，山羊精液冷凍保存技術(shù)的研究遠(yuǎn)較其他家畜冷凍精液的發(fā)展緩慢。關(guān)于遼寧絨山羊精液冷凍稀釋液的研究未見報(bào)道，為了更好地開發(fā)和利用遼寧絨山羊這一獨(dú)特的生物資源，本文將對遼寧絨山羊精液冷凍稀釋液的配方進(jìn)行研究。

1 試驗(yàn)方法

1.1 精液的采集

用假陰道法采精，采精后首先，用肉眼進(jìn)行觀察，公羊政策射精量平均1ml，顏色乳白色或乳黃色，無異味。其次用低倍顯微鏡（100倍）觀察精子密度和活動(dòng)。在顯微鏡視野中，可看到翻騰云霧狀態(tài)，精子密度越大，活動(dòng)越強(qiáng)，其云霧狀越明顯。最后，在高倍顯微鏡（300～600倍）下評定精準(zhǔn)活動(dòng)及密度。在載玻片上滴精液1滴，加載玻片，在顯微鏡下看精子活動(dòng)方式有直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)、回旋運(yùn)動(dòng)和擺動(dòng)三種。直線運(yùn)動(dòng)越多，活力就越大。直線運(yùn)動(dòng)精子只有達(dá)到60%以上，才能供使用。

1.2 精液的稀釋

采集合格的精液混勻后分別用六組基礎(chǔ)稀釋液（表1）稀釋，精液先緩慢放進(jìn)六個(gè)離心管內(nèi)，在緩慢加入等溫的稀釋液，邊加邊混勻，精液與稀釋液的比例為1：3。

表1 六種基礎(chǔ)稀釋液配方

1.3 平衡

精液稀釋后用十層紗布或者衛(wèi)生紙包裹好放進(jìn)4℃冰箱，或者把稀釋好的精液離心管放進(jìn)水里然后放入4℃冰箱。精液平衡期間不能隨便從平衡槽里取出來。

1.4 分裝及冷凍

用1ml注射器（把200μl取樣槍頭從中間剪開，將尖頭部插入注射器頭部）將精液吸入0.25 ml的細(xì)管內(nèi)，精液裝細(xì)管時(shí)最好戴上手套，避免手的溫度使其升溫，管尾部留約1cm的空間，以備封口用，然后放入封口機(jī)進(jìn)行封管標(biāo)識(shí)，封管用細(xì)管輸送封裝機(jī)，封管后用液氮冷凍以備后用。

1.5 精液品質(zhì)的測定方法

取出分裝后的冷凍精子樣品分別進(jìn)行精子活率的測定，質(zhì)膜完整率的檢測，頂體完整率的檢測，線粒體活性檢測。

1.6 結(jié)果與分析

經(jīng)過SPSS V13.0軟件分析后，對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在所選用的6種冷凍稀釋液中。E組稀釋液凍后精子活率，頂體完整率，質(zhì)膜完整率，線粒體活性均顯著高于A、C、F組的稀釋液（P＜0.05）。與B、D組稀釋液相比效果不顯著（P＞0.05），但各項(xiàng)指標(biāo)都相對高于B、D組稀釋液。因此篩選出E組冷凍稀釋液，作為遼寧絨山羊精液冷凍稀釋液的配方。

2 討論

本實(shí)驗(yàn)通過比較6種冷凍稀釋液對精液冷凍解凍后活率、頂體完整率、質(zhì)膜完整率與線粒體活性的效果，初步篩選出山羊細(xì)管冷凍基礎(chǔ)稀釋液E（100ml）：Tris 3.44g，檸檬酸1.83g，果糖1.26g，卵黃15%，甘油5%。Tris具有良好的緩沖性和滲透性，適宜于長期冷凍保存，Tris與檸檬酸將稀釋液的酸堿度維持在一個(gè)相對穩(wěn)定的范圍內(nèi)，可以起到維持精子生存環(huán)境相對穩(wěn)定。果糖幾乎是近幾年在國內(nèi)外動(dòng)物精液冷凍稀釋液中必不可少的添加物。果糖是牛和人的精液中存在的唯一的還原糖。果糖實(shí)際上比葡萄糖更容易被代謝，因?yàn)樗梢岳@過糖酵解途徑的限速酶，6-磷酸果糖激酶-I?？梢钥焖俚亟o精子提供能量和營養(yǎng)。卵黃和精子融合后，能在精子表面形成保護(hù)膜，在冷凍過程中保持精子膜完整性。其中低密度脂蛋白（LDL）和磷脂是起到保護(hù)作用的有效成分。甘油能與細(xì)胞里的水分子結(jié)合，使溶液黏性增加，減少冷凍過程中冰晶的形成，在眾多的冷凍保護(hù)劑中沒有發(fā)現(xiàn)那一種的冷凍保護(hù)效果能優(yōu)于甘油。