宋建新，歐陽(yáng)紅梅，甸自金，聞 艷，蔣雅先，湯一菲，撒亞蓮

(云南省第一人民醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.血液科；3.臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，昆明 650032)

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在骨髓增生異常綜合征患者中的表達(dá)研究*

宋建新1，歐陽(yáng)紅梅1，甸自金1，聞 艷2，蔣雅先1，湯一菲1，撒亞蓮3△

(云南省第一人民醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.血液科；3.臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，昆明 650032)

目的 探討CD68 (M1型+M2型)非惡性免疫性血液病患者、CD163 (M2型) 陽(yáng)性巨噬細(xì)胞在骨髓增生異常綜合征(MDS)患者骨髓中的表達(dá)。方法 采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)20例非惡性免疫性血液病患者，25例低危MDS患者，17例高危MDS患者骨髓組織中CD68、CD163的表達(dá)。結(jié)果 CD68和CD163的表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在MDS低危組分別為30.78±5.77和8.50±2.48，在對(duì)照組中為12.59±2.59 和2.74±0.77，其差異在兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高危組CD68表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為61.26±4.21，高于對(duì)照組及低危組(P<0.05)；高危組CD163表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為49.59±4.88，高于對(duì)照組和低危組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MDS病情進(jìn)展與CD163浸潤(rùn)密度具有相關(guān)性(r=0.648，P<0.05)。結(jié)論 巨噬細(xì)胞在MDS患者骨髓中具有較高的浸潤(rùn)密度，且逐漸向M2型巨噬細(xì)胞極化，同時(shí)與MDS的病程進(jìn)展具有相關(guān)性。

骨髓增生異常綜合征；骨髓；巨噬細(xì)胞；CD68；CD163

骨髓增生異常綜合征(myelodysplastie syndrome，MDS)是一組起源于造血干細(xì)胞，以骨髓病態(tài)造血，外周血一系或多系血細(xì)胞減少和高風(fēng)險(xiǎn)轉(zhuǎn)化為急性白血病為特征的高度異質(zhì)性疾病[1-2]。目前MDS的發(fā)病機(jī)制及其疾病進(jìn)展的機(jī)制依舊不明。巨噬細(xì)胞(macrophages)是一類(lèi)廣泛分布于體內(nèi)、動(dòng)態(tài)的、具有遷移性的異質(zhì)細(xì)胞群體，是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分[3]。在不同微環(huán)境作用下，巨噬細(xì)胞可極化為具有不同分子特征和功能特征的M1型或M2型，其對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展起著截然相反的作用[4]。M1型巨噬細(xì)胞具有抗原提呈和吞噬腫瘤細(xì)胞等細(xì)胞毒性效應(yīng)，而M2型巨噬細(xì)胞參與腫瘤細(xì)胞的惡性增殖、抵抗凋亡，以及侵襲和轉(zhuǎn)移，故又被稱(chēng)為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)。已有研究表明，CD68是人源巨噬細(xì)胞的泛標(biāo)志物(M1型+M2型)，CD163是識(shí)別M2型的標(biāo)志物[3-4]。既往對(duì)巨噬細(xì)胞與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后關(guān)系的研究主要集中于實(shí)體瘤、淋巴瘤等方面[5-6]，而在MDS中的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本文采用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)MDS患者骨髓組織中巨噬細(xì)胞表面的分子標(biāo)志CD68、CD163來(lái)明確其在MDS發(fā)生、發(fā)展中的變化，探討巨噬細(xì)胞在MDS發(fā)病中的作用，為闡明MDS發(fā)病機(jī)制提供重要信息。

1 資料與方法

1.1 一般資料 42例病例均來(lái)自本院血液科門(mén)診及住院的初診MDS患者，其中男29例，女13例，年齡51～83歲，中位年齡67歲。根據(jù)WHO(2008)分型標(biāo)準(zhǔn)，其中難治性貧血(RA)8例，難治性貧血伴有環(huán)狀鐵粒幼細(xì)胞(RARS)8例，難治性血細(xì)胞減少伴有多系發(fā)育異常(RCMD)6例，難治性血細(xì)胞減少伴有多系發(fā)育異常和環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞(RCMD-RS)3例，難治性貧血伴有原始細(xì)胞過(guò)多難治性貧血伴有原始細(xì)胞過(guò)多(RAEB)-Ⅰ 8例，RAEB-Ⅱ9例。根據(jù)國(guó)際預(yù)后積分系統(tǒng)(IPSS)，低危8例，中危-1 17例，中危-2 8例，高危9例。將低危和中危-1定義為低危組(n=25)，將中危-2和高危定義為高危組(n=17)。同時(shí)，選擇非惡性免疫性血液病患者20例作為對(duì)照組，年齡、性別相匹配。本研究獲本倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并征得所有受試者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 鼠抗人CD68、CD163抗體，SP免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自Abcam公司。

1.2.2 試驗(yàn)方法 常規(guī)骨髓穿刺取骨髓組織，置于10% 甲醛固定液中交本院病理科進(jìn)行脫水，石蠟包埋處理。

1.2.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)CD68、CD163在骨髓組織中的表達(dá) 取骨髓活檢組織的石蠟塊，切3～4 μm厚的切片；采用SP免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)CD68、CD163的表達(dá)。染色步驟為：二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，3%過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性過(guò)氧化酶，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，進(jìn)行抗原微爐熱修復(fù)，正常山羊血清封閉，滴加一抗， 4 ℃孵育過(guò)夜；PBS清洗3次，滴加二抗，室溫孵育10 min，PBS清洗3次；滴加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，顯微鏡下控制顯色時(shí)間在10～15 min，自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染胞核，脫水透明，中性樹(shù)膠封片。對(duì)照組用PBS替代一抗，其余步驟相同。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果由2位病理醫(yī)師各自獨(dú)立判斷，結(jié)果相同者為最終檢驗(yàn)結(jié)果，若有異議，由上級(jí)醫(yī)師進(jìn)行最終判斷。在細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)有黃褐色或棕黃染色沉著物為陽(yáng)性。巨噬細(xì)胞體積較大，形態(tài)多樣，呈類(lèi)圓形或不規(guī)則形，偶見(jiàn)有多核細(xì)胞。在低倍鏡(100倍)下選取5個(gè)染色較好的視野，后在高倍鏡下(400倍)計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1CD68和CD163在骨髓組織中的表達(dá)CD68在對(duì)照組、低危組和高危組中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為12.59±2.59、30.78±5.77和61.26±4.21。低危組高于對(duì)照組(t=13.22，P<0.05)，高危組高于低危組(t=18.63，P<0.05)。CD163在對(duì)照組、低危組和高危組中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為2.74±0.77、8.50±2.48、49.59±4.88。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，CD163在低危組患者表達(dá)高于對(duì)照組(t=9.98,P<0.05)，高危組CD163表達(dá)明顯高于對(duì)照組和低危組(t=42.38、35.94，P<0.05)，見(jiàn)圖1。

A：CD68在對(duì)照組中的表達(dá)；B：CD163在對(duì)照組中的表達(dá)；C：CD68在低危組的表達(dá)；D：CD163在低危組的表達(dá)；E：CD68在高危組的表達(dá)；F：CD163在高危組的表達(dá)。

圖1CD68與CD163在3組中的表達(dá)(×400)

2.2CD68和CD163表達(dá)的相關(guān)性 在對(duì)照組中CD163表達(dá)明顯低于CD68的表達(dá)(P<0.05)；在低危組中，CD163浸潤(rùn)密度有所增加，但仍明顯低于CD68(P<0.05)；高危組中CD68與CD163表達(dá)均明顯增高，但二者相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而CD163增高與CD68均呈明顯正相關(guān)(r=0.824，P<0.05)。

2.3MDS與病情進(jìn)展的相關(guān)性 對(duì)高危組和低危組CD163進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，患者的病情進(jìn)展與CD163浸潤(rùn)密度具有相關(guān)性(r=0.648，P<0.05)。

3 討 論

巨噬細(xì)胞分布在機(jī)體的各種組織中，發(fā)揮吞噬、趨化、分泌活性物質(zhì)的作用，同時(shí)參與和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答；其既參與維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的平衡狀態(tài)，又對(duì)疾病的形成起到促進(jìn)作用[3]。巨噬細(xì)胞作為骨髓微環(huán)境的一個(gè)重要成員，在某些特定的細(xì)胞因子作用下可活化為T(mén)AMs，參與惡性腫瘤細(xì)胞的生存、增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移，并與預(yù)后不良相關(guān)[3-6]。但目前對(duì)于MDS患者骨髓巨噬細(xì)胞的表達(dá)及其與病情進(jìn)展的關(guān)系并不清楚。CD68相對(duì)分子質(zhì)量約為110×103，是巨噬細(xì)胞的泛標(biāo)記物(M1型+M2型)；CD68及其配體參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，并可直接作用于腫瘤細(xì)胞，影響其凋亡及對(duì)藥物的反應(yīng)性。CD163是M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)記物，在炎癥環(huán)境中通過(guò)與配體結(jié)合促進(jìn)單核細(xì)胞黏附、游出，并誘導(dǎo)炎性介質(zhì)白細(xì)胞介素(IL)-10等細(xì)胞因子的釋放參與腫瘤細(xì)胞免疫逃逸[3,7]。

M1型巨噬細(xì)胞通過(guò)提呈抗原，分泌促炎癥細(xì)胞因子和趨化因子，參與Th1型免疫應(yīng)答，發(fā)揮抗腫瘤作用[8]。M2型巨噬細(xì)胞抗原提呈能力較弱，分泌IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)等參與誘導(dǎo)Th2型免疫應(yīng)答，抑制免疫，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移的過(guò)程[3-7]。本文通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)MDS患者骨髓組織中巨噬細(xì)胞的數(shù)量隨病情發(fā)展而增多，低危組CD68、CD163巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯高于對(duì)照組，高危組明顯高于低危組。而在對(duì)照組中CD163表達(dá)明顯低于CD68(P<0.05)；低危組中，CD163浸潤(rùn)密度有所增加，但仍明顯低于CD68(P<0.05)，提示在對(duì)照組和MDS低危組骨髓微環(huán)境中，主要是以M1型巨噬細(xì)胞為主。由于M1型巨噬細(xì)胞可分泌包括腫瘤壞死因子(TNF)在內(nèi)的多種炎性因子，這在一定程度上也解釋了早期MDS骨髓細(xì)胞凋亡程度較為嚴(yán)重[9]。高危組中CD68與CD163表達(dá)均明顯增高，CD68高于CD163，但二者相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，同時(shí)CD163增高與CD68均呈明顯正相關(guān)，說(shuō)明在MDS高危組中，是以M2型巨噬細(xì)胞在數(shù)量和功能上占優(yōu)勢(shì)。由此可見(jiàn)，MDS患者骨髓組織中巨噬細(xì)胞數(shù)量隨著病情發(fā)生、發(fā)展而增加，并向M2型巨噬細(xì)胞極化，提示M2型巨噬細(xì)胞是MDS病情向不良方向發(fā)展的一個(gè)預(yù)警指標(biāo)。

MDS患者骨髓微環(huán)境中M2型巨噬細(xì)胞的增多，可能是在MDS細(xì)胞來(lái)源的趨化因子、細(xì)胞因子的作用下[2-4]，將外周血單核細(xì)胞大量招募進(jìn)入骨髓后分化為巨噬細(xì)胞；在IL-10、IL-4等因子刺激下，極化為M2型巨噬細(xì)胞即TAMs；而TAMs本身也能分泌大量的CCL2、IL-10、TGF-β和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，通過(guò)正向反饋促進(jìn)巨噬細(xì)胞的招募與極化[10-12]；因此，推測(cè)骨髓中巨噬細(xì)胞與MDS細(xì)胞間相互作用，形成一個(gè)惡性擴(kuò)增環(huán)。但鑒于MDS發(fā)病的多因素性和巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)機(jī)制的復(fù)雜性，對(duì)于MDS患者骨髓中的巨噬細(xì)胞還有待進(jìn)一步研究。

總之，MDS患者骨髓巨噬細(xì)胞的大量募集并逐漸向M2型極化，改變了骨髓微環(huán)境，使其更適合培育細(xì)胞惡性生物學(xué)行為，有利于腫瘤細(xì)胞的生存和增殖分化，推動(dòng)MDS的發(fā)生、發(fā)展。

[1]Garcia-ManeroG.Myelodysplasticsyndromes:2015Updateondiagnosis,risk-stratificationandmanagement[J].AmJHematol,2015,90(9):831-841.

[2]CogleCR,SakiN,KhodadiE,etal.Bonemarrownicheinthemyelodysplasticsyndromes[J].LeukRes,2015,39(10):1020-1027.

[3]SchultzeJL,SchmiederA,GoerdtS.Macrophageactivationinhumandiseases[J].SeminImmunol,2015,27(4):249-256.

[4]YangC,HeL,HeP,etal.Increaseddrugresistanceinbreastcancerbytumor-associatedmacrophagesthroughIL-10/STAT3/bcl-2signalingpathway[J].MedOncol,2015,32(2):352.

[5]CaoW,PetersJH,NiemanD,etal.Macrophagesubtypepredictslymphnodemetastasisinoesophagealadenocarcinomaandpromotescancercellinvasioninvitro[J].BrJCancer,2015,113(5):738-746.

[6]徐原林，王華慶，錢(qián)正子，等．M2型巨噬細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤組織中的含量及其與患者預(yù)后的關(guān)系[J]．中華腫瘤雜志，2013，35(6)：450-455．

[7]李海濤，譚超，田書(shū)梅，等．腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的作用新進(jìn)展[J]．腫瘤防治研究，2015，42(11)：1165-1168．

[8]YinY,HuangX,LynnKD,etal.Phosphatidylserine-targetingantibodyinducesM1macrophagepolarizationandpromotesmyeloid-derivedsuppressorcelldifferentiation[J].CancerImmunolRes,2013,1(4):256-268.

[9]沙琨．骨髓增生異常綜合征骨髓細(xì)胞凋亡與TNF-α關(guān)系的探討[J]．中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2014，9(23)：91-92．

[10]ChenL,YuanW,ChenZ,etal.Vasoactiveintestinalpeptiderepressesactivationoftumor-associatedmacrophagesingastriccancerviaregulationofTNFα,IL-6,IL-12andiNOS[J].IntJOncol,2015,47(4):1361-1370.

[11]史兆坤，丁鵬，孫杰，等．單核細(xì)胞趨化蛋白-1趨化巨噬細(xì)胞遷移與侵襲的體外實(shí)驗(yàn)研究[J]．昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，35(4)：41-45．

[12]趙陽(yáng)，趙勇．單核-巨噬細(xì)胞起源及發(fā)育分化的特征與分子調(diào)控[J]．中國(guó)免疫學(xué)雜志，2014，30(1)：126-132．

?驗(yàn)交流·

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.02.025

云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合專(zhuān)項(xiàng)應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目資助(2014FZ070)。

宋建新(1964-)，副主任技師，大專(zhuān)，主要從事細(xì)胞形態(tài)學(xué)診斷和流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用方面研究?！?/p>

R55

B

1671-8348(2017)02-0228-03

2016-07-10

2016-11-25)