唐 倩，徐穎倩，劉應(yīng)杰，曾 雪 綜述，劉應(yīng)杰 審校

(重慶醫(yī)藥高等?？茖W校藥學院 401331)

·綜述· doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.28.040

新型抗血小板靶標磷酸肌醇3-激酶β的研究進展*

唐 倩，徐穎倩△，劉應(yīng)杰，曾 雪 綜述，劉應(yīng)杰 審校

(重慶醫(yī)藥高等?？茖W校藥學院 401331)

磷酸肌醇3-激酶；抗血栓治療靶標；血栓形成；心血管疾??；動脈剪切力

當血管壁受損時，人體會啟動止血途徑來保護損傷的血管，但是抗凝血因子超出了正常調(diào)控范圍，參與凝血的物質(zhì)就會積聚于血管壁，導致病理性血栓形成?？寡“逅幨侵委熝ǖ囊活愔匾乃幬铮渲饕匝“寰奂^程中的某些關(guān)鍵物質(zhì)或信號途徑作為治療靶標，下調(diào)血小板整合素αⅡbβ3(GPⅡbⅢa)的黏附功能，達到治療血栓的效果[1]。目前，抗血小板藥物在治療過程中，很可能抑制正常的止血途徑而引發(fā)出血性并發(fā)癥。在血管壁損傷處，血流剪切力明顯增加，而高血流剪切力又會進一步導致血小板的激活與血栓的形成[2]。為了達到抑制病理性血栓形成而不影響正常生理性止血的目的，可將血小板中響應(yīng)高血流剪切力的特異性信號途徑(或者特異性物質(zhì))作為治療靶標，選擇性地下調(diào)高剪切力調(diào)控的血小板中整合素αⅡbβ3的黏附能力。在血小板被激活的信號途徑中，磷酸肌醇3-激酶β(PI3Kβ)會特異性地響應(yīng)高血流剪切力而被激活，進而增強αⅡbβ3的粘附能力,促進血小板聚集，因此，PI3Kβ對于研發(fā)新型的抗血栓藥物極具潛在價值[3]。本文介紹了PI3Kβ參與并形成血栓的信號途徑，并歸納總結(jié)了PI3Kβ作為抗血小板治療靶標的研究成果，為以PI3Kβ為靶標治療血栓可進行的后續(xù)研究工作提供有力的參考價值。

1 PI3Kβ的結(jié)構(gòu)及功能

PI3Kβ是異二聚體酶，由一個催化亞基和一個調(diào)控亞基組成，其中催化亞基與Src-同源體2(SH2)結(jié)構(gòu)域相結(jié)合[4]。研究表明，PI3Kβ的激活與酪氨酸激酶相關(guān)，酪氨酸激酶通過酪氨酸磷酸化基序與PI3Kβ的SH2結(jié)構(gòu)域相互作用，使調(diào)控亞基募集并激活催化亞基，從而激活PI3Kβ使其發(fā)揮作用，也有研究表明，PI3Kβ在血小板中可以通過G蛋白的G-β/γ亞基和酪氨酸磷酸肽的協(xié)同作用而被激活。PI3Kβ在血栓的形成過程中發(fā)揮了非常重要的作用，PI3Kβ能特異性地響應(yīng)高血流剪切力，上調(diào)血小板整合素αⅡbβ3的黏附力和穩(wěn)定性，促進動脈粥樣硬化破裂斑塊處的血小板聚集，導致血栓形成，并且有研究證實PI3Kβ抑制劑能有效地抑制血栓的形成而不影響正常的止血過程[5]。

1.1PI3Kβ促進血小板激活 當受損的血管壁暴露于纖維狀膠原時，血小板會與膠原黏附，然后被糖蛋白Ⅵ(GPⅥ)信號通路誘導活化，PI3Kβ會參與GPⅥ依賴性Ca2+信號通路及血小板的形成過程，應(yīng)用PI3Kβ抑制劑能夠選擇性地抑制GPⅥ信號通路的下游事件，從而抑制血小板的激活[6]。有研究發(fā)現(xiàn)在PI3Kβ缺陷的血小板中，脂質(zhì)第二信使磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PIP3)的產(chǎn)量減少，蛋白激酶B的活性也受到了強烈的抑制，而這兩種物質(zhì)也參與了血小板的活化過程，因此，可以說明PI3Kβ在血小板激活中占據(jù)重要地位[7]。凝血酶與血小板表面的蛋白酶活化受體1(PAR1)結(jié)合，通過一系列信號通路提高血小板整合素αⅡbβ3的黏附能力，從而使血小板激活，PI3Kβ是凝血酶激活血小板下游信號通路中的重要物質(zhì)，PI3Kβ信號通路與PAR1介導的血小板穩(wěn)定聚集相關(guān)，運用PI3K抑制劑干預(yù)可減少PAR1介導的持續(xù)的血小板活化[8]。研究表明，PI3Kβ還參與了腺苷二磷酸(ADP)誘導的血小板活化，運用PI3Kβ抑制劑和單獨的PI3Kβ構(gòu)型敲除的情況下，由ADP誘導的血小板活性降低，并且血小板聚集變得不穩(wěn)定，運用特異性的PI3Kβ抑制劑顯示，在不增加出血時間的同時，可防止大鼠和兔動脈血栓的形成，從而證明了PI3Kβ在ADP誘導的血小板活化中發(fā)揮著重要作用[9]。在凝血惡烷A2(TXA2)誘導的血小板活化中，可以檢測到PI3Kβ的代謝物和PIP3，并且運用PI3Kβ特異性抑制劑可抑制血小板的聚集，證明PI3Kβ在TXA2誘導的血小板活化信號通路中也起到了重要的作用[10]。

1.2PI3Kβ促進血小板黏附和聚集 誘導血小板活化的信號途徑最終都會激活血小板整合素αⅡbβ3。αⅡbβ3是血小板上的一種黏附受體，其主要作用是上調(diào)血小板-血管壁和血小板-血小板之間的黏附作用、促進血小板聚集，因此，血栓的形成主要依賴于整合素αⅡbβ3黏附的信號途徑的啟動。PI3Kβ選擇性抑制劑能夠抑制整合素αⅡbβ3的黏附接觸，從而抑制血栓的形成，限制PI3Kβ的表達后，降低了血小板-血小板之間的接觸作用，并且初始的血栓形成也得到了延遲[11]。有研究報道利用PI3Kβ缺陷的老鼠模型，證明了PI3Kβ能增強αⅡbβ3鍵的親和力，在PI3Kβ缺陷的血小板中，纖維蛋白凝塊的聚集得以延遲，這些血小板幾乎不能黏附于纖維蛋白原上，說明PI3Kβ有促進αⅡbβ3激活的作用，進而促進了血小板的黏附和聚集[12]。

2 PI3Kβ參與血栓形成的信號途徑

PI3Kβ參與了多種促進血栓形成的信號途徑，主要有P2Y12受體、凝血酶受體和GPVI介導的血小板活化的信號傳導。研究PI3Kβ在這些信號途徑中的作用，有利于理解PI3Kβ作為抗血栓治療靶標的機制，也為PI3Kβ作為一種新型抗血栓治療靶標的研究奠定了理論基礎(chǔ)。

2.1PI3Kβ參與P2Y12介導的信號通路 P2Y12是血小板表達的Gi蛋白偶聯(lián)的嘌呤受體，ADP是一種生理激動劑，它能夠通過與P2Y12結(jié)合而發(fā)揮相關(guān)的生理作用，ADP激發(fā)的血小板效應(yīng)主要通過P2Y12受體的相關(guān)信號通路來完成，P2Y12受體激活后可導致一系列的細胞內(nèi)事件：鈣離子(Ca2+)的移動,調(diào)控顆粒的釋放,TXA2的產(chǎn)生,整合素αⅡbβ3的激活,血小板聚集的信號放大并穩(wěn)定血小板聚集。剪切力誘導血小板活化，需要GPIb和整合素αⅡbβ3信號功能的相互作用并配合P2Y12受體被激活后逐漸放大的信號，當ADP與P2Y12結(jié)合后，會激活PI3Kβ，促使其參與Gi蛋白依賴的信號處理過程，PI3Kβ激活后能進一步誘導Rap1b蛋白的激活，Rap1b是Ras家族的一種GTP酶，它在調(diào)節(jié)整合素的黏附功能上有明確的作用，進而維持了整合素αⅡbβ3的激活狀態(tài)和血小板的穩(wěn)定聚集[13]。

2.2PI3Kβ參與PAR1和PAR4介導的信號通路 凝血酶是一種主要的血小板激活劑，能夠通過一些受體放大信號而激活血小板，它還能夠使纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，在凝血級聯(lián)放大反應(yīng)中有著重要的作用。PAR1和PAR4是血小板表面通過蛋白質(zhì)水解而激活的兩種凝血酶受體，與Gq蛋白偶聯(lián)，當外部蛋白質(zhì)的N端序列水解后，新暴露的N端能夠作為配體來發(fā)揮受體的功能。PAR激活后，能夠通過磷脂酶Cβ(PLCβ)將PI(4,5)P2水解并產(chǎn)生第二信使肌醇-3-磷酸和甘油二酯(DAG)，其中肌醇-3-磷酸能導致鈣離子從胞內(nèi)釋放，而DAG會激活蛋白激酶C(PKC)，并且PAR1和PAR4還能通過釋放ADP而激活P2Y12受體，通過以上系列事件導致整合素αⅡbβ3激活并促進血栓的形成[14]。PI3Kβ參與了PAR1依賴的信號通路，PI3Kβ被激活后會產(chǎn)生PIP3，PIP3可以促進PLCβ產(chǎn)生第二信使，并通過PKB/Akt磷酸化作用來實現(xiàn)其激活整合素αⅡbβ3的功能，而PI3Kβ和PAR4在維持凝血酶所誘導的整合素αⅡbβ3激活和血小板聚集的過程中屬平行關(guān)系[15]。

2.3PI3Kβ參與GPVI介導的信號通路 現(xiàn)在普遍認為vWf和膠原蛋白在血管凝塊的啟動中起著重要作用，當血小板表面的受體GPIb-Ⅸ-Ⅴ和GPⅥ分別與vWf和膠原蛋白相互作用引發(fā)血小板的聚集，最近的研究表明，GPⅥ受體在促進血小板黏附和血栓形成過程中占有主導地位。GPⅥ是免疫球蛋白超家族成員，與免疫受體酪氨酸活化基序(ITAM)--FcRγ鏈非共價結(jié)合，F(xiàn)cRγ鏈的酪氨酸被磷酸化并觸發(fā)一系列的下游信號事件：產(chǎn)生PIP3，使細胞質(zhì)Ca2+移動，激活整合素αⅡbβ3，分泌裝載著ADP和ATP的血小板顆粒，血小板表面的磷脂酰絲氨酸(PS)負電荷暴露以確保凝血[16]。PI3Kβ參與了整個PIP3形成和Ca2+信號產(chǎn)生的過程，暗示著PI3Kβ在激活PLCγ2的過程中也是必要的酶，通過激活PLCγ2而完成GPⅥ相關(guān)的信號通路，PI3Kβ缺陷會抑制Ca2+的增加和PS的暴露，從而減少了血小板的聚集。

3 以PI3Kβ為靶標治療血栓的潛在藥物

近年來許多科研機構(gòu)和制藥企業(yè)致力于研發(fā)PI3K抑制劑，但是在臨床上PI3Kβ的特異性抑制劑仍然匱乏。目前，設(shè)計與開發(fā)PI3Kβ特異性抑制劑的常用方法有：應(yīng)用X射線、分子對接、分子動力學模擬、化學探針等技術(shù)對已有的PI3K抑制劑進行結(jié)構(gòu)分析，并對其結(jié)構(gòu)進行改造和優(yōu)化，開發(fā)出PI3Kβ特異性抑制劑。例如，Kim等[17]通過對氨基嘧啶的分子結(jié)構(gòu)進行改造，在磺酰胺基上結(jié)合一個苯環(huán)或者將磺酰胺基上的苯基用萘基取代后，得到了一種選擇性和效能更強的PI3Kβ抑制劑，氨基嘧啶的衍生物對PI3Kβ的選擇性和抑制性更強。

3.1PI3Kβ非特異性抑制劑 PI3Kβ非特異性抑制劑主要有：LY294002、PI-103、NVP-BEZ235、渥曼青霉素等。LY294002和渥曼青霉素是最早研發(fā)出的PI3K抑制劑，LY294002是經(jīng)黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)改造合成獲得的，它是一種ATP競爭性的非選擇性PI3K抑制劑，可以透過血小板細胞抑制PI3K/Akt信號途徑，但其對PI3K亞型的選擇性較差，抑制效力較低，藥動學性質(zhì)也較差。渥曼青霉素是從真菌代謝產(chǎn)物中提取得到的，通過抑制普列克底物蛋白的磷酸化來抑制血小板的激活和聚集，渥曼青霉素能抑制血小板5-羥色胺的釋放，其抑制普列克底物蛋白的機制與5-羥色胺類似。PI-103通過抑制細胞生長以及誘導G1期的細胞周期阻滯，抑制了人腫瘤細胞的PI3K/Akt激活[18]。NVP-BEZ235是咪唑喹啉酮的衍生物[4-5]，它是一種雙激酶抑制劑，能同時靶向PI3K和mTOR通路，通過競爭性結(jié)合ATP而影響PI3K/Akt/mTOR信號通路下游相關(guān)分子的表達水平[19]。

3.2PI3Kβ特異性抑制劑 經(jīng)典的PI3Kβ特異性抑制劑主要有AZD6482和TGX221，都有抗血栓的功能，并且已進入臨床Ⅰ期試驗。AZD6482是一種強效、強選擇性的PI3Kβ抑制劑，它通過與ATP競爭性地結(jié)合相應(yīng)位點，選擇性地抑制PI3Kβ，它對PI3Kβ的抑制性比對PI3Kδ、PI3Kα和PI3Kγ分別強8、87和109倍。在動物實驗中，AZD-6482表現(xiàn)出非常強的抗血栓作用，且未引起出血和出血時間的延長，對健康志愿者的實驗表明，AZD-6482同樣具有很好的抗血小板聚集作用以及很短的出血時間[20]。TGX221可以抑制由2MeS-ADP誘導的血小板凝聚，血栓烷A2的生成，Akt和胞外信號調(diào)節(jié)激酶的磷酸化[21]。近年來也涌現(xiàn)出了一些新型的PI3Kβ特異性抑制劑，如KIN-193、AZD8186、SAR260301、MIPS-9922等，這些抑制劑都表現(xiàn)出了對PI3Kβ異構(gòu)體較高的選擇性，其中MIPS-9922能有效地抑制ADP誘導的血小板聚集，并且在高血流剪切力下抑制了血小板整合素αⅡbβ的活性，在不延長出血時間的前提下抑制了血小板聚集[5]。

3.3具有PI3K靶向的天然化合物 許多天然化合物也具有作為PI3Kβ抑制劑的潛在價值，并且天然物質(zhì)具備毒副作用小，多靶點等優(yōu)勢。研究表明，丹酚酸A、蘿卜硫素、山柰酚等一些從天然物質(zhì)中提取的化合物對PI3K途徑都有明顯有效的抑制作用。丹酚酸A是丹參的水溶性有效成分，研究表明，丹酚酸A抑制了血小板Akt的磷酸化，將丹酚酸A和PI3K抑制劑LY294002、TGX-221進行對比試驗，證明了丹酚酸A的作用靶點是PI3K[22]。蘿卜硫素是從西蘭花、芥藍等十字花科植物中提取出的活性成分，有研究發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素選擇性地抑制了PI3K/Akt信號途徑，蘿卜硫素雖然不能直接抑制PI3K的催化活性，但是它能使PI3K的調(diào)控亞基蛋白泛素化，阻止PI3K遷移至細胞膜，從而抑制PI3K/Akt信號途徑，山柰酚可以很大程度地減弱凝血酶刺激的PI3K/Akt磷酸化，而且在3種血栓動物模型和印跡控制區(qū)老鼠中，山柰酚也體現(xiàn)出其很好地抗血栓效果[23]。

4 展 望

PI3Kβ激活血小板可以依賴于多種信號通路，對于這些信號通路的研究，能闡釋其在血栓形成過程中的作用和機制，為PI3Kβ作為一種新型的抗血栓治療靶標奠定了理論基礎(chǔ)。但PI3Kβ響應(yīng)動脈剪切力信號而激活血小板的機制還存在諸多問題有待探索：P2Y12/Gi信號通路與其他血小板激動劑所激活的信號通路協(xié)同作用激活PI3Kβ的機制仍不清楚；異源三聚體G蛋白和酪氨酸激酶協(xié)同激活PI3Kβ的機制也有待進一步研究；PI3Kβ激活整合素αⅡbβ的機制尚不清晰，有可能是通過酪氨酸激酶和P2Y12/Gi兩條信號途徑的相互作用。因此，闡釋清楚PI3Kβ的激活機制以及PI3Kβ在血小板激活和血栓形成過程中的作用機制仍需眾多基礎(chǔ)研究。初步的研究表明，PI3Kβ對其他細胞的增殖和生存沒有太大的影響，但PI3Kβ在其他細胞中的功能和重要性還需進一步研究，以確保抑制PI3Kβ的藥物不會對正常細胞的正常生理功能產(chǎn)生負面影響。設(shè)計和開發(fā)以PI3Kβ為靶點的特異性抑制劑可以通過以下幾種途徑：(1)基于PI3Kβ的結(jié)構(gòu)和每部分結(jié)構(gòu)域的功能設(shè)計特異性抑制劑；(2)研究已知的PI3K抑制劑針對PI3Kβ異構(gòu)體的特異性，并根據(jù)PI3Kβ與抑制劑結(jié)合的活性部位的結(jié)構(gòu)對這些PI3K抑制劑的結(jié)構(gòu)進行改造和優(yōu)化；(3)研究已知的廣譜蛋白酶抑制劑(如槲皮黃酮、楊梅酮星形孢菌素等)與PI3Kβ的活性部位的結(jié)合情況，并確定每種抑制劑的半數(shù)抑制濃度，從而篩選出有特異性強的PI3Kβ抑制劑，設(shè)計或者篩選出抑制PI3Kβ的化合物后，再進一步對這種化合物進行研究、改進和臨床研究。PI3Kβ作為一種響應(yīng)動脈剪切力從而誘導血小板活化的酶，是一種有潛力抗血栓治療的理想靶標。將PI3Kβ作為靶標的藥物和治療方法能夠?qū)崿F(xiàn)在不影響正常止血的前提下，選擇性地抑制高剪切力所誘導的病理性血栓的形成，所以，基于PI3Kβ的抗血栓藥物的研究有著巨大的潛在價值。

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重慶市科委基礎(chǔ)與前沿基金資助項目(cstc2014jcyjA10125)；重慶市高等教育教學改革研究重點基金資助項目(142083)；重慶醫(yī)藥高等專科學?？蒲杏媱澔鹳Y助項目(ygz2015107)。

唐倩(1979-)，副教授，碩士，主要從事新藥研發(fā)及質(zhì)量分析研究?！?/p>

，E-mail：alicexu0410@126.com。

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1671-8348(2017)28-4000-04

2017-04-21

2017-06-19)