黃述斌，侯永微，李松梅，王志強(qiáng)，徐 亮，王海平

乳腺癌組織及間質(zhì)浸潤淋巴細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)及其意義

黃述斌，侯永微，李松梅，王志強(qiáng)，徐 亮，王海平

目的探討程序性死亡配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）在乳腺癌組織及間質(zhì)浸潤淋巴細(xì)胞（stromal tumor-infiltrating lymphocyte，sTIL）中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系。方法收集 68例乳腺非特殊性浸潤性癌，采用免疫組化EliVision兩步法檢測PD-L1蛋白表達(dá)，并分析其與免疫組化亞型及臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果乳腺腫瘤細(xì)胞中PD-L1總陽性率為35.3%，尤其在三陰型乳腺癌腫瘤細(xì)胞中的陽性率最高，在管腔型、HER-2過表達(dá)型及三陰型乳腺癌腫瘤細(xì)胞中的陽性率分別為16.1%、37.5%、61.9%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PD-L1在 sTIL中的總陽性率為51.5%，且在三陰型乳腺癌中最高，陽性率為81.0%；PD-L1在管腔型、HER-2過表達(dá)型及三陰型乳腺癌 sTIL中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PD-L1在乳腺癌與sTIL中的表達(dá)呈正相關(guān)。結(jié)論P(yáng)D-L1在三陰型乳腺癌中表達(dá)明顯高于其他類型乳腺癌，阻斷 PD-L1／PD-1信號通路，有望成為乳腺癌尤其是三陰型乳腺癌免疫治療的新策略。

乳腺腫瘤；免疫組化亞型；程序性死亡配體-1；免疫治療

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，其基因表達(dá)譜分型對指導(dǎo)臨床治療非常重要，目前被廣泛使用的是用免疫組化替代基因譜分析進(jìn)行分型，依據(jù)ER、PR、HER-2、CK5／6、EGFR以及Ki-67的表達(dá)，將其分為管腔A型、管腔B型、HER-2過表達(dá)型、基底細(xì)胞樣型和未分類型；其中基底細(xì)胞樣型和未分類型統(tǒng)稱為三陰型乳腺癌［1］。管腔型和 HER-2過表達(dá)型目前均有成熟的靶向治療藥物，但三陰型乳腺癌尚未有特異性的靶向藥物，采用常規(guī)化療不敏感；某些靶向藥物治療效果不佳的患者在后期缺乏有效的治療方案。因此，尋找乳腺癌尤其是三陰型乳腺癌的治療靶點(diǎn)是當(dāng)務(wù)之急。

程序性死亡配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）是負(fù)性共刺激分子 B7家族成員，其在肺癌、惡性黑色素瘤等腫瘤中表達(dá)水平較高，針對性的靶向藥物MPDL3280A在臨床試驗(yàn)中有較好效果。國外文獻(xiàn)對乳腺癌中 PD-L1的表達(dá)已有相關(guān)報(bào)道，但國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道較少。本文采用免疫組化EliVision兩步法檢測68例不同免疫組化亞型非特殊性乳腺浸潤性癌以及腫瘤間質(zhì)浸潤淋巴細(xì)胞（stromal tumor-infiltrating lymphocyte，sTIL）中 PD-L1的表達(dá)，分析其差異及與臨床病理特征的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料收集池州市人民醫(yī)院 2014年1月 ～2016年4月手術(shù)切除的有完整資料的 68例乳腺非特殊性浸潤性癌，術(shù)前均未接受輔助化療。所有病例均經(jīng)我院兩位高年資病理醫(yī)師確診并提取原有免疫組化結(jié)果重新評估，依據(jù)文獻(xiàn)中免疫組化替代分型方案分為五種免疫組化亞型：管腔 A型、管腔B型、HER-2過表達(dá)型、基底細(xì)胞樣型和未分類型。其中管腔 A型和 B型統(tǒng)稱為管腔型，基底細(xì)胞樣型和未分類型統(tǒng)稱為三陰型。標(biāo)本均經(jīng) 10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋切片。

1.2 方法免疫組化染色采用 EliVision兩步法，兔抗人PD-L1單克隆抗體（SP142）及EliVision檢測試劑盒均購自福州邁新公司；具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。用胎盤組織作為陽性對照，乳腺癌旁正常乳腺組織作為陰性對照，PBS代替一抗作為空白對照，DAB顯色，蘇木精襯染。

1.3 結(jié)果判讀PD-L1染色陽性為胞膜和（或）胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒。PD-L1染色結(jié)果根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分率進(jìn)行半定量分析［2］：陽性細(xì)胞數(shù) ＜1%為（－），1%～5%為（＋），6%～10%為（?），＞10%為（?）；腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的判定依據(jù)國際TIL評價(jià)工作組推薦［3］，以 sTIL作為分析對象，評分方法同上；（－）為陰性，（＋～?）為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用 SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，PD-L1表達(dá)與免疫組化亞型及臨床病理特征的關(guān)系、腫瘤細(xì)胞與 sTIL中表達(dá)相關(guān)性均采用 χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法分析，各因素間的關(guān)系應(yīng)用多因素 Logistic回歸分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特點(diǎn)68例非特殊性乳腺浸潤性癌患者均為女性，年齡 32～86歲，平均（55.4±12.7）歲；腫瘤最大徑0.8～9 cm，平均（3.2±1.6）cm；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 40例（58.8%）。組織學(xué)分級：Ⅰ級4例（5.9%）、Ⅱ級 38例 （55.9%）、Ⅲ級 26例（38.2%）。管腔型31例（45.6%）、HER-2過表達(dá)型16例（23.5%）、三陰型21例（30.9%）。

2．2 PD-L1在腫瘤及 sTIL中的過表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系PD-L1過表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小和淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移無關(guān)，但在腫瘤細(xì)胞和 sTIL中的表達(dá)均與病理分級有關(guān)。PD-L1在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級腫瘤細(xì)胞中陽性率分別為 0.0（0／4）、26.3%（10／38）、42.3%（14／26）；在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級腫瘤sTIL中的陽性率分別為 25.0%（1／4）、39.5%（15／38）、73.1%（19／26），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。多因素 Logistic回歸分析結(jié)果顯示，只有病理分級對腫瘤細(xì)胞陽性率和 sTIL陽性率具有顯著的影響作用，與病理分級為Ⅰ級相比，Ⅲ級患者的腫瘤陽性率和 sTIL陽性率分別增加了 10.27（2.44～43.28）和9.06（2.12～38.79）倍。

2．3 PD-L1在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)與乳腺癌免疫組化亞型的關(guān)系乳腺浸潤性癌周圍間質(zhì)往往存在淋巴細(xì)胞浸潤（圖1），PD-L1在35.3%的浸潤性乳腺癌腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，表現(xiàn)為胞膜和（或）胞質(zhì)陽性（圖2），其中在三陰型乳腺癌中的陽性率最高，在管腔型、HER-2過表達(dá)型及三陰型乳腺癌中的陽性率分別為16.1%（5／31）、37.5%（6／16）、61.9%（13／21），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2）。

2．4 PD-L1在 sTIL中的表達(dá)與乳腺癌免疫組化亞型的關(guān)系PD-L1在51.5%的浸潤性乳腺癌的sTIL中表達(dá)（圖3），其中在三陰型乳腺癌 sTIL中的陽性率最高，在管腔型、HER-2過表達(dá)型及三陰型乳腺癌的sTIL中陽性率分別為 35.5%（11／31）、43.8%（7／16）、81.0%（17／21），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表3）。

2．5 PD-L1在腫瘤細(xì)胞與 sTIL中表達(dá)的相關(guān)性

PD-L1在腫瘤細(xì)胞及 sTIL中的表達(dá)呈明顯正相關(guān)（χ2＝8.067，P＝0.004 5，表4），部分病例在腫瘤細(xì)胞與sTIL中 PD-L1均呈強(qiáng)陽性。

表1 PD-L1在腫瘤細(xì)胞和sTIL中的表達(dá)及與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

表2 PD-L1在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)與乳腺癌免疫組化亞型的關(guān)系［n（%）］

表3 PD-L1在sTIL中表達(dá)與乳腺癌免疫組化亞型的關(guān)系［n（%）］

圖1 A.腫瘤周圍少量間質(zhì)浸潤淋巴細(xì)胞；B.腫瘤周圍中等量間質(zhì)浸潤淋巴細(xì)胞；C.腫瘤周圍大量間質(zhì)浸潤淋巴細(xì)胞 圖2 A.腫瘤細(xì)胞中PD-L1呈（＋），EliVision兩步法；B.腫瘤細(xì)胞中PD-L1呈（?），EliVision兩步法；C.腫瘤細(xì)胞中PD-L1呈（?），EliVision兩步法 圖3 A.sTIL中PD-L1呈（＋），EliVision法；B.sTIL中PD-L1呈（?），EliVision兩步法；C.sTIL中PD-L1呈（?），EliVision兩步法

表4 PD-L1在腫瘤細(xì)胞與 sTIL中表達(dá)的相關(guān)性［n（%）］

3 討論

PD-L1是相對分子質(zhì)量為4.0×104的Ⅰ型跨膜蛋白，通常免疫系統(tǒng)會對聚集在淋巴結(jié)或脾臟的外來抗原產(chǎn)生反應(yīng)，促進(jìn)具有抗原特異性的T細(xì)胞增生。細(xì)胞程序化死亡受體-1（programmed death receptor-1，PD-1）與PD-L1結(jié)合，可以傳導(dǎo)抑制性的信號，下調(diào)抗原刺激的淋巴細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致淋巴細(xì)胞“耗盡”以及誘導(dǎo)免疫耐受［4－5］。PD-L1除表達(dá)于腫瘤周圍的 sTIL外，還可以在不同的惡性腫瘤如肺癌［6－8］、膀胱癌［9］、惡性黑色素瘤［10］等腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。有文獻(xiàn)報(bào)道腫瘤細(xì)胞能夠逃避免疫監(jiān)視，其中可能的重要機(jī)制是 PDL1表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，其表達(dá)水平與腫瘤的不良預(yù)后有相關(guān)性。

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，其中三陰型乳腺癌目前尚未有特異性的靶向藥物，常規(guī)化療效果不佳。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 54.4%的乳腺非特殊性浸潤性癌表達(dá) PD-L1，其中在三陰型乳腺癌中陽性率為81.0%；三陰型乳腺癌中 PD-L1在腫瘤細(xì)胞和sTIL中的表達(dá)比管腔型和 HER-2過表達(dá)型均更高，與 Cimino-Mathews等［11］報(bào)道一致。Ghebeh等［12］發(fā)現(xiàn)乳腺癌PD-L1的陽性率為50%，其中34%在腫瘤上皮細(xì)胞中表達(dá)，41%在sTIL中表達(dá)；他們發(fā)現(xiàn)PDL1在瘤內(nèi)的表達(dá)與組織學(xué)分級和激素受體陰性有關(guān)。本組結(jié)果也顯示PD-L1在腫瘤細(xì)胞及 sTIL中的表達(dá)均與組織學(xué)分級有關(guān)，以高級別的浸潤性癌表達(dá)最為顯著。Ali等［13］發(fā)現(xiàn)PD-L1在原發(fā)性乳腺癌中的總陽性率較低，但約 1／5的基底樣細(xì)胞型腫瘤含有浸潤的免疫細(xì)胞且表達(dá) PD-L1。通過對 PDL1的擴(kuò)增觀察發(fā)現(xiàn)基底樣細(xì)胞癌受PD-L1的影響，雖然病例較少，但卻發(fā)生在所有的基底細(xì)胞樣腫瘤中。提示 PD-L1抑制藥可能對一小群表達(dá) PD-L1的乳腺癌女性患者（大部分為基底樣細(xì)胞型）有效。Mittendorf等［14］通過 RNA序列分析數(shù)據(jù)顯示 PD-L1在三陰型乳腺癌中的表達(dá)明顯高于非三陰型乳腺癌（P＜0.001）；他們發(fā)現(xiàn)PTEN缺失是在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控PD-L1的一種機(jī)制，它是通過PI3K通路信號發(fā)揮作用。三陰型乳腺癌中 PD-L1表達(dá)的增加對T細(xì)胞產(chǎn)生功能性影響，包括 T細(xì)胞增殖的減少和凋亡增多。

然而，Muenst等［15］研究顯示PD-L1表達(dá)與 Ki-67／HER-2的表達(dá)呈正相關(guān)，與 ER表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與 PR表達(dá)無關(guān)，在不同的乳腺癌亞型中無明顯差異。這與本組 PD-L1在三陰型乳腺癌中表達(dá)明顯高于其他類型的結(jié)果不同，可能是由于 Muenst等［15］的研究樣本采用的是 TMA，而 PD-L1在腫瘤中的表達(dá)具有異質(zhì)性，組織芯片樣本的局限性可能導(dǎo)致結(jié)果的差異。有文獻(xiàn)報(bào)道［16］，利用體內(nèi)影像技術(shù)進(jìn)行PD-L1檢測，可以觀察腫瘤細(xì)胞整體的 PDL1表達(dá)情況和分布規(guī)律，避免表達(dá)異質(zhì)性對實(shí)驗(yàn)結(jié)論的影響，提高 PD-L1作為療效預(yù)測指標(biāo)的準(zhǔn)確率。

Beckers等［2］發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞與sTIL中同時(shí)表達(dá)PD-L1與預(yù)后好有關(guān)。本組結(jié)果顯示相對于PD-L1腫瘤陰性區(qū)域，腫瘤陽性區(qū)域周圍間質(zhì)浸潤淋巴細(xì)胞明顯增多，且表達(dá)PD-L1也增強(qiáng)。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，PD-L1在腫瘤細(xì)胞與sTIL中的表達(dá)呈正相關(guān)，提示PD-L1在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)直接受PD-L1＋sTIL的影響，其是否與腫瘤的預(yù)后直接相關(guān)，尚需進(jìn)一步隨訪；Pardoll［17］也支持該觀點(diǎn)，其認(rèn)為在腫瘤微環(huán)境中，免疫細(xì)胞產(chǎn)生的炎性因子如干擾素能上調(diào)腫瘤細(xì)胞表面 PD-L1的表達(dá)，并形成正反饋環(huán)路是腫瘤細(xì)胞逃避獲得性免疫的一種可能性機(jī)制。

PD-L1在乳腺癌中的部分病例中表達(dá)，在三陰型乳腺癌中表達(dá)明顯高于其他類型乳腺癌；其在腫瘤細(xì)胞和 sTIL中均有一定的陽性率，其表達(dá)與腫瘤的病理分級有關(guān)，且在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)與在 sTIL中的表達(dá)呈正相關(guān)。PD-L1在乳腺癌中的表達(dá)可能有多種機(jī)制，阻斷 PD-L1／PD-1信號通路，有望成為乳腺癌尤其是三陰型乳腺癌免疫治療的新策略。

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Expression and significance of PD-L1 in breast cancer tumor cells and tumor-infiltrating lym phocytes

HUANG Shu-bin，HOU Yong-wei，LISong-mei，WANG Zhi-qiang，XU Liang，WANG Hai-ping
（Department of Pathology，the People’s Hospital of Chizhou，Chizhou 247100，China）

PurposeTo investigate the expression of programmed death ligand-1（PD-L1）in breast cancer tumor cells and stromal tumor-infiltrating lymphocyte（sTIL），and to study the relationship between the expression of PD-L1 and the clinicopathological characteristics of the patients.M ethodThe protein expression of PD-L1 was detected by immunohistochemistry of EliVision two-step method in 68 cases of non special type of invasive breast cancer，and the relationship between the expression of PD-L1 protein and the immunohistochemistry subtypes and clinical parameters was analyzed.ResultsThe total expression rate of PD-L1 was 35.3%in breast tumor tissue，specially in triple negative breast cancer（TNBC）which occupy the highest positive rate.The expression rates of PD-L1 in tumor tissue of the luminal subtype，HER-2 over-expression subtype and TNBC subtype were 16.1%，37.5%and 61.9%respectively，and the difference was statistically significant.The total expression rate of PD-L1 in sTIL was 51.5%，and the highest expression rate was 81.0%in TNBC.There were significant differences of PD-L1 expression in sTIL of the luminal subtype，HER-2 over-expression subtype and TNBC subtype.Expression of PDL1 in tumor tissue and sTIL had a significant positive correlation.ConclusionPD-L1 expressed in TNBC was significantly higher than other types of breast cancer，which suggest the blocking of signal pathway of PD-1／PD-L1 may expected to become a new immunotherapy for breast cancer，especially for TNBC subtype.

breast neoplasm；immunohistochemistry subtype；programmed cell death ligand-1；immunotherapy

R 737.9

A

1001－7399（2017）01－0063－05

10.13315／j.cnki.cjcep.2017.01.016

接受日期：2016－11－10

安徽省池州市人民醫(yī)院病理科 247100

黃述斌，男，碩士，副主任醫(yī)師。

E-mail：iamhuangsb1978＠sina.com