劉興辰+高靜賢+劉茜

摘要：藥品包裝材料上市前需要做風險管理過程中的評價，評價中包括對其生物學安全性的評定。熱原屬于生物學評價中的一個重要檢測項目。本文以需要高溫滅菌處理的幾種藥品包裝材料為樣品，對清洗和未清洗的兩組樣品滅菌后進行兔熱原試驗以及細菌內毒素試驗。結果表明，未清洗樣品會對熱原產生影響。

關鍵詞：熱原；細菌內毒素

1 熱原檢查法（兔熱原法）

1.1實驗準備

1.1.1樣品來源 ①注射用冷凍干燥用覆聚四氟乙烯乙烯膜氯化丁基橡膠塞，批號：M150331122-78（江蘇華蘭藥用新材料股份有限公司）；②藥用合成聚異戊二烯墊片，批號：150353515-16（江蘇華蘭藥用新材料股份有限公司）。

1.1.2動物來源 南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場（許可證號SCXK（蘇）2012-0008）、合格證號：201505970、201506377、201506729，顆粒飼料，由南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供。

1.1.3器具除熱原 與供試品接觸的所有玻璃器皿置電熱干燥箱內250℃干烤30 min（實驗前1 d）。

1.1.4實驗分組 注射用冷凍干燥用覆聚四氟乙烯乙烯膜氯化丁基橡膠塞（下面簡稱橡膠塞）、藥用合成聚異戊二烯墊片（下面簡稱墊片）拆開包裝，用純化水清洗后，暴露在空氣中（普通環(huán)境）3 d。①橡膠塞未再洗；②橡膠塞經純化水水洗；③墊片未再洗；④墊片經純化水水洗。

1.1.5浸提介質（浸提液） 氯化鈉注射液（安徽雙鶴藥業(yè)有限責任公司），規(guī)格：500 ml，批號：150129 5T。

1.1.6供試品浸提液制作方法 橡膠塞：將供試品用純化水沖洗干凈后，用濾紙吸干，置浸提容器內。供試品置壓力蒸汽滅菌器內，115℃滅菌30 min后，按0.2 g/ml比例加入浸提液，使液體浸沒供試品。浸提條件37℃，24 h。

墊片：將供試品用純化水沖洗干凈后，用濾紙吸干，切成0.5 mm×3 cm條狀，置浸提容器內。供試品置壓力蒸汽滅菌器內，115℃滅菌30 min后，按規(guī)定量加入浸提液，使液體浸沒供試品。浸提條件37℃，24 h。

1.1.7供試用家兔及實驗室環(huán)境 供試用的家兔應健康合格，體重1.7 kg以上，雌兔應無孕。預測體溫前7 d即應用同一飼料飼養(yǎng)，在此期間內，體重應不減輕，精神、食欲、排泄等不得有異?，F(xiàn)象。家兔之前均未曾用于熱原檢查，經過預測體溫，挑選合格供試用家兔。在熱原檢查前2 d內，供試用家兔處于同一溫度的環(huán)境中，實驗室和飼養(yǎng)室的溫度相差1℃以內，溫度均在（21±1）℃。

1.2實驗方法 取適用的家兔3只，測定其正常體溫符合要求后15 min以內，自耳靜脈緩緩注入溫熱至約38℃的供試品溶液，注射劑量為10 ml//kg。然后每隔30 min按前法測量其體溫1次，共測6次，以6次體溫中最高的一次減去正常體溫，即為該兔的升高溫度（℃）。如3只家兔中有1只溫度升高0.6℃或高于0.6℃，或3只家兔體溫升高的總和達1.3℃或高于1.3℃，應另取5只家兔復試。檢查方法同上。

1.3結果 在初試的3只家兔中，體溫升高均低于0.6℃，并且3只家兔體溫升高總和低于1.3℃；或在復試的5只家兔中，體溫升高0.6℃或高于0.6℃的家兔不超過1只，并且初試、復試合并8只家兔的體溫升高總和為3.5℃或低于3.5℃，均判定供試品的熱原檢查符合規(guī)定。在初試的3只家兔中，體溫升高0.6℃或高于0.6℃的家兔超過1只；或在復試的5只家兔中，體溫升高0.6℃或高于0.6℃的家兔超過1只；或在初試、復試合并8只家兔的體溫升高總和超過3.5℃，均判定供試品的熱原檢查不符合規(guī)定。當家兔升溫為負值時，均以0計。

2 細菌內毒素檢查法

2.1實驗準備

2.1.1樣品來源 聚丙烯輸液瓶（由江蘇蘇中藥業(yè)集團股份有限公司提供），規(guī)格均為250 ml，批號為14081424、14081518、14081609。

2.1.2實驗儀器 混和器（天津藥典標準儀器廠）ZH-2，細菌內毒素凝膠法測定儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）ET-96，潔凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）SW-CJ-2F，隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津市泰斯特儀器有限公司）規(guī)格：GH6000，電熱恒溫鼓風干燥箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）DHG-143BS-III。

2.1.3器具除熱原 與供試品接觸的所有玻璃器皿置電熱干燥箱內250℃干烤30 mim（實驗前1 d）。

2.1.4供試品浸提液制作方法：取輸液容器剪成0.5 cm×3 cm小條，按內表面積（cm2）與水（6：1）混合，經（121±2）℃，60 min滅菌，放冷，備用，作為試驗液，并用同批水作為空白液。

2.1.5供試品細菌內毒限值 每1 ml供試液中含內毒素不得過0.25EU。

2.2實驗方法 凝膠法-通過鱟試劑與內毒素產生凝集反應的原理進行限度檢測或半定量檢測內毒素的方法。

按表1制備溶液A、B、C和D。使用稀釋倍數(shù)不超過MVD（確定最大有效稀釋倍數(shù)）并且已經排除干擾的供試品溶液來制備溶液A和B。按鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作。

2.3實驗結果，見圖1。

2.4結果判斷 保溫（60±2）min后觀察結果。若陰性對照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽性對照溶液B的平行管均為陽性，陽性對照溶液C的平行管均為陽性，試驗有效。若溶液A的兩個平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定。若溶液A的兩個平行管均為陽性，判定供試品不符合規(guī)定。若溶液A的兩個平行管中一管為陽性，另一管為陰性，需進行復試。復試時溶液A需做4支平行管，若所有平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定，否則判定供試品不符合規(guī)定。

3 討論

常用的三種熱原檢測方法，限于設備、試劑等條件，我們只能進行其中兩種-熱原檢查法（兔熱原法）、細菌內毒素檢測法進行熱原檢測。

雖然我們不能說未清洗就滅菌的熱原檢測就一定不合格，一定會給使用者帶來各種熱原反應的后果，但禍生于懈慢，藥品包裝材料的好壞直接關系到使用者的生命安危，防微杜漸，我們需要做的更多。

參考文獻：

[1]周德慶.微生物學教程[M].第3版.北京：高等教育出版社，2011：241.

[2]陳延京，張林，黃金星，等.復合膜過濾法采樣檢測空氣中的微生物[J].中國環(huán)境監(jiān)測，2005，21（4）：14-17.

[3]郭麗霞，石曉霞.對注射劑中熱原污染的探討[J].海峽藥學，2005，17 （5）：27-29.

編輯/蔡睿琳