趙希景

摘 要：本文以漳州古雷半島潮間帶沉積物作為研究對(duì)象，篩選出能夠發(fā)酵代謝產(chǎn)香蘭素的高產(chǎn)菌株。為海洋放線菌發(fā)酵代謝進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)做出理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：古雷半島潮間帶；香蘭素；阿魏酸

中圖分類(lèi)號(hào)：TQ920 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

0.引言

香蘭又名香草醛，香草素等，其化學(xué)名稱(chēng)為3-甲氧基-4-羥基苯甲醛，分子量為152.16，熔點(diǎn)81℃～83℃。具有香莢蘭的香氣以及濃郁的奶香，是人們所喜愛(ài)的奶油香草精的主要成分，為香料工業(yè)中最大的品種。因此其用途十分廣泛具有較高的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。本文研究從古雷半島潮間帶中分離得到了45株海洋放線菌，其中可以利用阿魏酸轉(zhuǎn)化生成香蘭素的菌株有8株；對(duì)該8株海洋放線菌進(jìn)行阿魏酸耐受性的篩選獲得了一株可以高產(chǎn)香蘭素的優(yōu)秀菌株；對(duì)其發(fā)酵條件的初步研究表明在溫度為35℃，pH為8.5，裝液量為100mL/500mL時(shí)發(fā)酵單位最高可達(dá)到11.2g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到75%以上。這對(duì)于海洋資源的開(kāi)發(fā)，以及微生物轉(zhuǎn)化法生成香蘭素提供了重要的理論依據(jù)。

1.材料和方法

1.1 樣品采集

樣品采集自漳州古雷半島潮間帶沉積物，去掉表層約10cm，使用預(yù)先備好的無(wú)菌樣品勺采集10cm～20cm深處的沉積物樣品1份，放入無(wú)菌三角瓶中，封口后放于冰盒中封存并帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行研究。

1.2 培養(yǎng)基

高氏一號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉20g，Nacl 0.5g，KNO3 1g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，瓊脂15g～25g，水1000mL，pH7.4～7.6。

放線菌發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨3.0g，酵母浸粉3.0g，葡萄糖20g，阿魏酸1.0g，海水100mL，定容至1000mL，初始pH為7.0～7.5，發(fā)酵pH為8.0～8.5。

菌種保藏培養(yǎng)基：酵母浸粉3.0g，蛋白胨3.0g，瓊脂粉15g～25g，海水100mL，定容至1000L，pH7.0～7.5。

1.3 樣品預(yù)處理

將1g樣品在55℃水浴中加熱5min；處理好后將沉積物樣品使用式溶液使用1/4林格式溶液進(jìn)行稀釋。將稀釋后的沉積物采用含有10%濃度海水的無(wú)菌水進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)徊捎闷桨逋坎挤▽⑵渫坎荚诤?0%海水的高氏一號(hào)培養(yǎng)基中，其中在培養(yǎng)基中添加千分之五的氨芐青霉素來(lái)抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，同時(shí)還需添加濃度為0.1g/mL的制霉菌素溶液用來(lái)抑制霉菌等真菌的生長(zhǎng)。28℃培養(yǎng)48h。

1.4 放線菌菌株分離與純化

將在高氏一號(hào)培養(yǎng)基中長(zhǎng)出的菌體，按照菌落大小，菌體形態(tài)，顏色等的不同挑選單菌落，采用點(diǎn)植法再次接種在含有10%海水的高氏一號(hào)培養(yǎng)基中。倒置培養(yǎng)與28℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48h。繼續(xù)挑選單菌落采用點(diǎn)植法進(jìn)行接種，重復(fù)劃線；重復(fù)上述步驟2～3次。將純化后的菌株使用保藏培養(yǎng)基進(jìn)行保藏待用。

1.5 目標(biāo)菌株的篩選

將分離得到的純菌株培養(yǎng)至250mL茄子瓶中，培養(yǎng)28h后使用無(wú)菌水將菌體洗下，搖勻待用；取1mL菌懸液接種于裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL搖瓶中于28℃180rpm搖床中培養(yǎng)28h。28h后將搖瓶取出12000rpm離心3min，取上清液過(guò)0.22μm水膜成為待測(cè)樣品。

1.6 香蘭素含量的測(cè)定

采用液相檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)；檢測(cè)條件為——柱子型號(hào)）色譜柱，流動(dòng)相為A，B為0.1%磷酸緩沖液：甲醇（Av/Bv）=55∶45，流速為0.8mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm紫外檢測(cè)，進(jìn)樣量為0.5μL。

2.結(jié)果與分析

2.1 海洋放線菌的分離純化

采用不同方式處理沉積物樣品對(duì)樣品分離放線菌的效果具有較大的影響，同時(shí)，取樣的時(shí)間、地點(diǎn)以及海水的深度等外界條件對(duì)放線菌獲得種類(lèi)，數(shù)量均有較大的影響。據(jù)報(bào)道，采用通過(guò)55℃水浴6min處理樣品可以獲得最大數(shù)量的放線菌。本研究采用該種方法供分離得到了放線菌菌株45株。

2.2 產(chǎn)香蘭素菌株的篩選

2.2.1 液相檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

使用香蘭素，阿魏酸的標(biāo)準(zhǔn)品配置一定梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用香蘭素液相的檢測(cè)方法進(jìn)樣，檢測(cè)出不同梯度濃度的香蘭素和阿魏酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線；香蘭素的線性回歸方程為Y=15479x-2.915，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，阿魏酸的線性回歸方程為Y=19393x-25.65，相關(guān)系數(shù)R2=0.999；均具有較好的線性關(guān)系。

2.2.2 目標(biāo)菌株的篩選

將分離得到的45株放線菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，48h檢測(cè)發(fā)酵液中香蘭素的含量，其結(jié)果見(jiàn)表1。

從表1所示，我們可以看出初篩所得到的45株菌株中僅有8株菌株在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)出香蘭素；其中，菌株B-32產(chǎn)量最高，在含有阿魏酸1g/L的發(fā)酵液中可轉(zhuǎn)化生成香蘭素0.71g/L。其菌體濃度可達(dá)到OD620為0.21。菌株B-7，B-16，B-22，B-25，B-28，B-38，B-44在該發(fā)酵培養(yǎng)中也可以轉(zhuǎn)化阿魏酸生成香蘭素，其香蘭素的摩爾轉(zhuǎn)化率均在70%以上。從表中我們可以看出菌株B-4，B-13，B-34，B-41該4株菌株在發(fā)酵液中均可以生長(zhǎng)，通過(guò)液相檢測(cè)其中阿魏酸的含量明顯減少，但是未發(fā)現(xiàn)有香蘭素的生成?？赡苁怯捎谠诎l(fā)酵過(guò)程中這4種菌可以利用阿魏酸產(chǎn)生其他類(lèi)的代謝產(chǎn)物，值得我們拿出進(jìn)行系統(tǒng)的研究。

結(jié)論

本研究從漳州古雷半島潮間帶沉積物中篩選出45株海洋放線菌，通過(guò)對(duì)45株放線菌進(jìn)行篩選獲得一株香蘭素的高產(chǎn)菌株B-32；并對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行初步的研究：在溫度為35℃，pH為8.5，裝液量為100mL/500mL條件下，可轉(zhuǎn)化生成11.6g/L香蘭素，轉(zhuǎn)化率達(dá)到75%以上；這對(duì)于通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化方式生產(chǎn)天然香蘭素提供了重要的理論依據(jù)。目前，對(duì)于菌株B-32發(fā)酵產(chǎn)香蘭素的發(fā)酵條件的進(jìn)一步優(yōu)化，諸如碳源，氮源等正在進(jìn)行中。

參考文獻(xiàn)

[1]陳曉菲，高向東，顧覺(jué)奮.海洋放線菌及其產(chǎn)物的多樣性[J].國(guó)外醫(yī)藥（抗生素分冊(cè)），2013（1）：1-5.