丁 航，李彩虹，馬衛(wèi)列，張志珍

（廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東 東莞 528000）

小鼠肝組織DNA的提取及鑒定綜合性實(shí)驗(yàn)在生物化學(xué)與分子生物學(xué)教學(xué)中的實(shí)施

丁 航，李彩虹，馬衛(wèi)列，張志珍*

（廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東 東莞 528000）

生物化學(xué)與分子生物學(xué)是醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)重要的基礎(chǔ)課程，實(shí)驗(yàn)教學(xué)尤其是綜合性實(shí)驗(yàn)教學(xué)對(duì)學(xué)生綜合技能的培養(yǎng)至關(guān)重要。從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路、組織實(shí)施、實(shí)施效果、教學(xué)體會(huì)等方面闡述小鼠肝組織DNA的提取及鑒定綜合性實(shí)驗(yàn)在生物化學(xué)與分子生物學(xué)教學(xué)中的實(shí)施，并分析教學(xué)中存在的問(wèn)題，提出相應(yīng)的對(duì)策，為有關(guān)院校進(jìn)行相關(guān)的綜合性實(shí)驗(yàn)教學(xué)提供參考。

小鼠肝組織DNA；綜合性實(shí)驗(yàn)；生物化學(xué)與分子生物學(xué)

生物化學(xué)與分子生物學(xué)是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床醫(yī)學(xué)密切聯(lián)系的學(xué)科，實(shí)驗(yàn)課是其教學(xué)的重要組成部分，是提高學(xué)生基本實(shí)驗(yàn)操作技能的主要手段，是培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立分析問(wèn)題、解決問(wèn)題能力的重要教學(xué)途徑之一，是學(xué)生后續(xù)專(zhuān)業(yè)技能學(xué)習(xí)與提高的必要基礎(chǔ)。為了幫助學(xué)生更好地理解生物化學(xué)與分子生物學(xué)的理論知識(shí)，通過(guò)開(kāi)展小鼠肝組織DNA的提取及鑒定綜合性實(shí)驗(yàn)，幫助學(xué)生克服對(duì)生物化學(xué)與分子生物學(xué)的抽象、畏難情緒，認(rèn)識(shí)到生物化學(xué)與分子生物學(xué)不再神秘，可以自如駕馭[1]。這樣不僅利于提高生物化學(xué)與分子生物學(xué)的教學(xué)質(zhì)量，而且能鍛煉學(xué)生綜合技能的運(yùn)用能力。

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理

真核細(xì)胞中，DNA以核蛋白形式存在于細(xì)胞核中。提取質(zhì)量較好的DNA產(chǎn)品應(yīng)該遵循兩個(gè)基本原則：一是要將DNA與蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、糖類(lèi)和RNA等充分分離；二是在操作過(guò)程中盡量避免DNA斷裂，保持其分子的完整性。

在各種動(dòng)物組織DNA提取方法中，最常用的經(jīng)典方法是酚/氯仿抽提法。本實(shí)驗(yàn)在小鼠肝組織DNA抽提過(guò)程中加入十二烷基硫酸鈉（Sodium Dodecyl Sulphate，SDS），可破壞細(xì)胞膜、核膜，并使組織蛋白與DNA分子分離；加入乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA），可抑制脫氧核糖核酸酶活性，減少DNA分子降解。釋放出來(lái)的DNA用酚/氯仿抽提，除去蛋白質(zhì)，然后用氯仿抽提，以除去DNA溶液中微量酚的污染，最后用無(wú)水乙醇使DNA沉淀析出，得到目的產(chǎn)物。

DNA的特征吸收峰位于260 nm處，測(cè)定出A260nm數(shù)值后，利用公式可推算出不同形式DNA樣品的濃度。分離提取DNA時(shí)主要的雜質(zhì)之一是蛋白質(zhì)，其特征吸收峰位于280 nm，同時(shí)測(cè)定出DNA樣品的A260nm值及A280nm值后，計(jì)算出A260nm/A280nm的值，大致可以判定產(chǎn)品的組成情況。

2 實(shí)驗(yàn)課程的內(nèi)容

2.1 肝勻漿的制備

斷頸法處死小鼠，立即取出肝臟，用冷生理鹽水洗去表面附著的血液，濾紙吸干多余水分，稍剪碎，放入玻璃勻漿器中，加入10 mL冷TE緩沖液，一手持勻漿管將下端插入待勻漿樣品中，另一手將搗管垂直插入套管中，上下轉(zhuǎn)動(dòng)研磨數(shù)十次（6～8分鐘），充分研碎，得到組織勻漿液。

2.2 提取DNA

（1）取0.2 mL勻漿液置于1.5 mL離心管中，加入10%SDS溶液0.2 mL，顛倒混勻，室溫放置5分鐘，溶液變黏稠。（2）取飽和酚0.25 mL，氯仿/異戊醇0.25 mL，加入上述溶液中，顛倒混勻，室溫放置5分鐘（其間不斷搖動(dòng)離心管以保持溶液呈乳狀），在4℃以12 000 r/min離心10分鐘。（3）取出離心管，小心吸取上層溶液，將其置入一支新的1.5 mL離心管中，加入0.5 mL氯仿/異戊醇，顛倒混勻，室溫放置5分鐘，在4℃以12 000 r/min離心5分鐘。（4）取出離心管，小心吸取上層溶液（記住溶液體積，可分多次吸取，避免吸到沉淀部分），將其置入一支新的1.5 mL離心管中。加入0.3倍上清液體積的10 mol/L NH4Ac溶液及2.5倍上清液體積的無(wú)水乙醇后，顛倒混勻，即可觀察到纖維狀DNA沉淀析出。在4℃以12 000 r/min離心5分鐘，小心倒去上層溶液，將離心管甩干，靜置5分鐘使乙醇揮發(fā)。加入1.0 mL TE緩沖液溶解DNA。

2.3 DNA的測(cè)定

將溶解的DNA樣品轉(zhuǎn)移到干凈試管中，加入3.0 mL TE緩沖液，混勻。以TE緩沖液為空白溶液調(diào)零，在紫外分光光度計(jì)上分別測(cè)定DNA溶液的A260nm值和A280nm值。

3 實(shí)施的效果

3.1 鞏固并拓展了所學(xué)知識(shí)，熟悉了實(shí)驗(yàn)基本原理和操作過(guò)程

由于生物化學(xué)與分子生物學(xué)這門(mén)課程的理論知識(shí)較為抽象，復(fù)雜難懂，學(xué)生在預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，需要查閱書(shū)本，上網(wǎng)觀看課程實(shí)驗(yàn)視頻或者在網(wǎng)上查找資料，以便更好地整理、融合、消化、理解實(shí)驗(yàn)原理、操作步驟和注意事項(xiàng)等，使生物化學(xué)的理論得到更加形象的驗(yàn)證。同時(shí)，幫助學(xué)生更清晰地認(rèn)識(shí)和更好地掌握這個(gè)實(shí)驗(yàn)所涉及的知識(shí)點(diǎn)。這正是每個(gè)綜合性實(shí)驗(yàn)所要達(dá)到的目的。

3.2 調(diào)動(dòng)了學(xué)生學(xué)習(xí)的積極性和主動(dòng)性

本綜合性實(shí)驗(yàn)改變了傳統(tǒng)的“實(shí)驗(yàn)課教師講學(xué)生聽(tīng)，學(xué)生再按照實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)機(jī)械地完成實(shí)驗(yàn)操作”的模式，這次實(shí)驗(yàn)課前，教師已要求學(xué)生預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)，要對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⒉僮鞒绦蚝鸵笥兴私?，查閱資料，開(kāi)拓思路，帶著問(wèn)題在實(shí)驗(yàn)課上動(dòng)手操作[2]。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中或在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的專(zhuān)題實(shí)驗(yàn)報(bào)告中，學(xué)生可以隨時(shí)提出自己對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程設(shè)計(jì)的想法。如此安排，對(duì)于調(diào)動(dòng)學(xué)生學(xué)習(xí)的積極性和主動(dòng)性很有幫助。在實(shí)驗(yàn)中環(huán)環(huán)相扣，往往上一個(gè)小實(shí)驗(yàn)的結(jié)果就是下一個(gè)小實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的前提，肝組織的研磨必須充分，這樣才能得到較高純度的DNA，進(jìn)而進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。這種實(shí)驗(yàn)安排促使學(xué)生必須認(rèn)真仔細(xì)地對(duì)待每一步操作，以獲得準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。若沒(méi)有獲得理想的結(jié)果，就要自己查找原因，促使學(xué)生成為整個(gè)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的主體。

3.3 加強(qiáng)了學(xué)生動(dòng)手能力

在以前傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式中，學(xué)生根據(jù)講義上所寫(xiě)的實(shí)驗(yàn)步驟和教師課堂講解進(jìn)行機(jī)械性操作，操作較為簡(jiǎn)單[3]。就本次綜合性實(shí)驗(yàn)而言，從殺鼠取肝、研磨、提取DNA到DNA含量測(cè)定，學(xué)生都需要格外小心，要全神貫注地操作，稍不注意就有可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗，在此過(guò)程中，大大提高了學(xué)生的動(dòng)手能力。

3.4 增強(qiáng)了團(tuán)隊(duì)意識(shí)

隨著現(xiàn)代科技的飛速發(fā)展，科學(xué)研究越來(lái)越重視團(tuán)隊(duì)合作，單靠一個(gè)人的力量很難事事通曉、面面俱到，因此，教師應(yīng)該有意識(shí)地培養(yǎng)學(xué)生與他人合作、交流、溝通的能力。在本次綜合性實(shí)驗(yàn)中，幾乎每一步都需要學(xué)生互相合作，這是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。因此，本實(shí)驗(yàn)有效地增強(qiáng)了學(xué)生的團(tuán)隊(duì)意識(shí)。

DNA的提取是生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)技術(shù)，提取的DNA的純度及結(jié)構(gòu)完整性是進(jìn)行基因工程各項(xiàng)研究所必需的條件。目前應(yīng)用較為廣泛的有親子鑒定、法醫(yī)鑒定、基因重組及疾病檢測(cè)等。另外，在基因工程研究中，常常需要提取分離基因組DNA，可用于構(gòu)建基因組文庫(kù)、Southern雜交及PCR分離基因等。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，可以使學(xué)生對(duì)DNA的提取有所了解、對(duì)DNA的提取研究有一個(gè)整體概念，從而提高學(xué)生的綜合能力，使他們所學(xué)知識(shí)更完整并得到升華。

[1]王寧，陳園園，李仲，等.淺談醫(yī)學(xué)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的改革與探索[J].教育教學(xué)論壇，2016（28）：272-273.

[2]徐宋瑤，薛昕，鄧?guó)P，等.醫(yī)藥類(lèi)院校生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革的探索與研究[J].繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育，2017，31（2）：20-21.

[3]王輝.病原生物學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)課教學(xué)改革及實(shí)踐[J].科技文匯，2016（11）：77-78.

G424．31

B

1671－1246（2017）22－0074－02

廣東醫(yī)科大學(xué)教學(xué)質(zhì)量與教學(xué)改革工程項(xiàng)目（JG1403）

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張志珍）