謝 偉，趙榮蘭，左愛軍，梁東春，孫 蓓*，郭 剛，張鏡宇

(1.包頭醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室生物醫(yī)學(xué)研究中心，內(nèi)蒙古包頭 014040；2.天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院內(nèi)分泌研究所/衛(wèi)生部激素與發(fā)育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300070)

甲狀腺激素受體βΔ的P-box氨基酸序列與轉(zhuǎn)錄激活作用關(guān)系的研究

謝 偉1，趙榮蘭2，左愛軍2，梁東春2，孫 蓓2*，郭 剛2，張鏡宇2

(1.包頭醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室生物醫(yī)學(xué)研究中心，內(nèi)蒙古包頭 014040；2.天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院內(nèi)分泌研究所/衛(wèi)生部激素與發(fā)育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300070)

研究新發(fā)現(xiàn)的甲狀腺激素受體(TR) TRβΔ的P-box氨基酸序列能否結(jié)合甲狀腺激素反應(yīng)元件(TRE)后增強(qiáng)靶基因轉(zhuǎn)錄，揭示P-box序列的保守性與TRβΔ轉(zhuǎn)錄激活作用的關(guān)系，驗(yàn)證TRβΔ的功能性和活性。構(gòu)建pcDNA3.1-TRβΔ真核表達(dá)載體質(zhì)粒和含有回文序列TRE的pGL3-Promoter/TRE報(bào)告基因載體。突變TRβΔ的P-box氨基酸序列對(duì)應(yīng)的DNA序列，分別構(gòu)建pcDNA3.1-TRβΔmut1、pcDNA3.1-TRβΔmut2突變質(zhì)粒。以上質(zhì)粒分組瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染至COS-7細(xì)胞中，分別用含有T3和不含T3的培養(yǎng)基處理后，檢測(cè)各組熒光素酶的活性。以上載體經(jīng)PCR、雙酶切和質(zhì)粒測(cè)序證實(shí)均構(gòu)建成功。與TRβ1相比，TRβΔ的P-box序列僅在最后一位不同，但基本保證了完整性。在加入T3后，TRβΔ正常與TRE結(jié)合，激活報(bào)告基因表達(dá)，熒光素酶活性顯著增加(P<0.01)。將P-box序列突變?yōu)榕cTRβ1一致的pcDNA3.1-TRβΔmut1，在T3調(diào)節(jié)下也能顯著提高熒光素酶的表達(dá)(P<0.01)。但完全破壞P-box序列的pcDNA3.1-TRβΔmut2與TRβΔ相比，其熒光素酶的表達(dá)顯著降低(P<0.01)。結(jié)果證明，TRβΔ只有通過完整保守的P-box氨基酸序列，在T3的調(diào)節(jié)下才能與TRE正常結(jié)合，產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄激活作用。TRβΔ是有轉(zhuǎn)錄因子性質(zhì)的功能性TR。

甲狀腺激素受體新亞型TRβΔ；甲狀腺激素反應(yīng)元件；P-box氨基酸序列；轉(zhuǎn)錄激活

甲狀腺激素(thyroid hormones,THs)是一類重要的激素[1]，可在細(xì)胞核內(nèi)與其特異性的甲狀腺激素受體(thyroid hormone receptor,TR)結(jié)合，后者識(shí)別靶基因啟動(dòng)子上游或編碼區(qū)下游的甲狀腺激素反應(yīng)元件(thyroid response element,TRE)并與之特異性的結(jié)合，最終在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)靶基因進(jìn)行正性/負(fù)性調(diào)控，對(duì)于正常的細(xì)胞分化、發(fā)育和新陳代謝過程具有重要作用[2]。

本實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行甲狀腺激素受體的研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的TRβ亞型并命名為TRβΔ (GenBank DQ191165)。經(jīng)過對(duì)TRβΔ mRNA序列分析發(fā)現(xiàn)，較 TRβ1在第3和4外顯子之間多出了108 bp的序列，但序列不引起讀碼框兩翼的改變。TRβΔ mRNA序列經(jīng)翻譯得到比TRβ1多36個(gè)氨基酸殘基的受體蛋白。這36個(gè)氨基酸殘基是TRβΔ與TRβ1的唯一區(qū)別[3]。然而這36個(gè)氨基酸恰好位于TRβΔ高度保守的DNA結(jié)合域 (DNA-binding domain,DBD)中“P-box”之后，這種現(xiàn)象是否會(huì)影響其與TRE的正常結(jié)合，從而改變受體的轉(zhuǎn)錄激活作用，則需要試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證[4]。因此，本文研究通過克隆、表達(dá)、突變TRβΔ受體蛋白等方法，鑒定TRβΔ受體對(duì)T3的響應(yīng)性以及DBD中P-box氨基酸序列的保守性與受體轉(zhuǎn)錄激活作用的關(guān)系，為全面闡明新發(fā)現(xiàn)的TRβΔ受體的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和載體 載體pETDuet-TRβΔ以及非洲綠猴腎成纖維細(xì)胞系COS-7，本實(shí)驗(yàn)室保存；載體pcDNA3.1，Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.1.2 試劑 轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體Lipofectamine 2000，Invitrogen公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶、TaqDNA聚合酶、T4連接酶和dNTP，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-Promoter和熒光素酶檢測(cè)試劑盒(luciferase assay system)，Promega公司產(chǎn)品；Top10感受態(tài)以及基因定點(diǎn)突變?cè)噭┖校本┤浇鹕锛夹g(shù)有限公司產(chǎn)品；TRβ受體一抗，美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品；β-actin一抗，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品；二抗，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶，美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；引物合成和構(gòu)建質(zhì)粒的測(cè)序，由北京奧科生物技術(shù)有限公司完成。

1.1.3 主要儀器 PCR儀(Veriti 96)，美國(guó)ABI公司產(chǎn)品；電泳轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀(Scientific MultiSkan FC)，美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 pcDNA3.1-TRβΔ真核表達(dá)載體質(zhì)粒構(gòu)建 以pETDuet-TRβΔ載體為模板，上游引物5′-GGAAGCTTATGACTCCTAAC-3′；下游引物5′-GGGAATTCTCAGTCCTCAAAG-3′，擴(kuò)增TRβΔ序列，片段大小1 562 bp，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 2 min，共30個(gè)循環(huán)；再經(jīng)72 ℃ 10 min。其中上、下游引物各包含EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增得到的TRβΔ序列經(jīng)EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切后，與同樣經(jīng)雙酶切的pcDNA3.1空載體進(jìn)行連接，之后轉(zhuǎn)化進(jìn)入Top10感受態(tài)菌。使用雙酶切和PCR對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，經(jīng)測(cè)序后確定序列的正確性。

1.2.2 含有回文序列TRE的pGL3-Promoter報(bào)告基因載體構(gòu)建 以pGL3-Promoter報(bào)告基因載體為模板，上游引物5′-GATCCTCAGGTCATG-ACCTGAGGAGATCTGCGATCTGCATC-3′(上游引物含有作為TRE類型之一的回文序列: AGGTCATGACCT)；下游引物5′-GAGCCCGGGCTAGCACGCGTAAG-3′，擴(kuò)增片段5 010 bp，反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 6 min，共30個(gè)循環(huán)；再經(jīng)72 ℃ 10 min?；厥誔CR產(chǎn)物，T4連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)入Top10感受態(tài)菌，提取質(zhì)粒后首先進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳篩選出5 010 bp片段，然后進(jìn)行XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切篩選，如果無法將原始質(zhì)粒切為2 000 bp和3 000 bp左右的2個(gè)片段，將該質(zhì)粒送測(cè)序鑒定是否構(gòu)建成功。

1.2.3 pcDNA3.1-TRβΔmut1真核表達(dá)載體構(gòu)建 以pcDNA3.1-TRβΔ為模板，設(shè)計(jì)突變上游引物5′-CTGTGAAGGCTGCAAGGGTTCTCACACCAGAGACG-3′；下游引物5′-CGTCTCTGGTGTGAGAACCCTTGCAGCCTTCACAG-3′，該對(duì)引物使原始質(zhì)粒DBD中P-box氨基酸序列對(duì)應(yīng)的DNA序列CCT突變?yōu)镚GT，反應(yīng)條件為95℃ 5 min；95℃ 40 s，60℃ 1 min，68℃ 7 min，共18個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后加入1 μL DMT酶于PCR產(chǎn)物中，37℃孵育1 h。產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入Top10感受態(tài)菌，提取質(zhì)粒送測(cè)序鑒定。

1.2.4 pcDNA3.1-TRβΔmut2真核表達(dá)載體構(gòu)建 步驟方法與1.2.3一致，只有引物不同，上游引物5′-CTGCATCACCTGTGGAGCCTGCAAGCCTTCTCAC-3′;下游引物5′-GTGAGAACGCTTGCAGGCTCCACAGGTGATGCAG-3′，該引物使原始質(zhì)粒DBD中P-box氨基酸序列對(duì)應(yīng)的DNA序列GAA突變?yōu)镚GA，GGC突變?yōu)镚CC。

1.2.5 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞 將培養(yǎng)于含有100 ml/L新生牛血清、無雙抗DMEM完全培養(yǎng)基中COS-7細(xì)胞接種于6孔板中，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% 的CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)直到細(xì)胞到80%匯合后，將培養(yǎng)基換為無血清、無雙抗DMEM完全培養(yǎng)基準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。質(zhì)粒DNA與Lipofectamine 2000的比例為1 μg∶1 μL。共設(shè)立12個(gè)轉(zhuǎn)染組別，每組設(shè)立3副孔(表1)。

表1 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞分組

以上各組Lipofectamine 2000和重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入6孔板中，在培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染4 h～6 h，結(jié)束后吸出轉(zhuǎn)染液，加入正常生長(zhǎng)培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，將各孔中無雙抗培養(yǎng)基換為有雙抗的培養(yǎng)基，并在相應(yīng)組中加入T3 (0.25 nmol/L)。于轉(zhuǎn)染結(jié)束后48 h收集各組細(xì)胞，酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光素酶活性和吸光度值。

1.2.6 COS-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染后TRβΔ受體蛋白表達(dá)測(cè)定 轉(zhuǎn)染結(jié)束后，分別收集CTRL、T2、M1、M2組細(xì)胞，提取蛋白并定量后進(jìn)行Western blot鑒定。在100 g/L SDS-PAGE中進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h。分別加入1∶200稀釋的鼠抗TRβ受體一抗和1∶1 000稀釋的鼠抗β-actin一抗，4℃孵育過夜。HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗以1∶5 000的稀釋比例，于37℃孵育膜1 h。使用ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影和曝光。

1.2.7 熒光素酶報(bào)告基因活性測(cè)定 收集各孔細(xì)胞，去除培養(yǎng)基并用PBS清洗3次。使用熒光素酶檢測(cè)試劑盒(Luciferase Assay System)中的裂解液裂解細(xì)胞(320 μL/孔)，100 μL發(fā)光底物與20 μL細(xì)胞裂解液充分混合后，放入酶標(biāo)儀中測(cè)讀熒光素酶光度值。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-TRβΔ的構(gòu)建和鑒定

重組質(zhì)粒pcDNA3.1-TRβΔ構(gòu)建完成后，經(jīng)PCR鑒定,可見1 562 bp的片段(圖1A)。質(zhì)粒由EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后，得到5 000 bp左右的線性化載體和1 562 bp的片段(圖1A)。測(cè)序結(jié)果證實(shí)其與TRβΔ序列完全一致，表明pcDNA3.1-TRβΔ表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.2 pGL3-Promoter/TRE報(bào)告基因載體構(gòu)建和鑒定

將pGL3-Promoter載體進(jìn)行突變而得到的pGL3-Promoter/TRE重組質(zhì)粒，其大小與pGL3-Promoter載體類似，為5 010 bp(圖2A)。由于pGL3-Promoter/TRE重組質(zhì)粒XhoⅠ多克隆位點(diǎn)的序列已突變?yōu)榛匚男蛄?，所以該質(zhì)粒經(jīng)XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切后，只得到線性化的5 010 bp片段(圖2A)，而pGL3-Promoter質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后可得2 000 bp和3 000 bp左右的片段(圖2A)。此外，經(jīng)測(cè)序證實(shí)，TRE回文序列AGGTCATGACCT已成功引入pGL3-Promoter載體中，且前后有若干堿基保護(hù)(圖2B)。以上兩方面結(jié)果均證實(shí)pGL3-Promoter/TRE報(bào)告基因載體構(gòu)建成功。

2.3 pcDNA3.1-TRβΔmut1真核表達(dá)載體構(gòu)建和鑒定

由pcDNA3.1-TRβΔ載體進(jìn)行突變而得到的pcDNA3.1-TRβΔmut1突變質(zhì)粒，經(jīng)DNA測(cè)序鑒定后，發(fā)現(xiàn)其DBD中P-box氨基酸序列對(duì)應(yīng)的DNA序列CCT已突變?yōu)镚GT，由脯氨酸P突變?yōu)楦拾彼酖，P-box氨基酸保守序列由CEGCKP突變?yōu)镃EGCKG，僅將最后一位氨基酸改變，使得突變后的序列與TRβ1的P-box氨基酸保守序列一致 (圖3 A)。測(cè)序證實(shí)pcDNA3.1-TRβΔmut1真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.4 pcDNA3.1-TRβΔmut2真核表達(dá)載體構(gòu)建和鑒定

突變完成后的pcDNA3.1-TRβΔmut2質(zhì)粒，經(jīng)DNA測(cè)序鑒定后，發(fā)現(xiàn)其DBD中P-box氨基酸序列對(duì)應(yīng)的DNA序列GAA已突變?yōu)镚GA，由谷氨酸E突變?yōu)楦拾彼酖。GGC已突變?yōu)镚CC，由甘氨酸G突變?yōu)楸彼酇。P-box氨基酸保守序列由CEGCKP變?yōu)镃GACKG，保守序列發(fā)生重大改變(圖3B)。測(cè)序證實(shí)pcDNA3.1-TRβΔmut2真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

A.重組質(zhì)粒pcDNA3.1-TRβΔ的PCR和雙酶切鑒定結(jié)果；1、2.pcDNA3.1-TRβΔ的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3、4.pcDNA3.1-TRβΔ的EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切產(chǎn)物；5.未酶切的pcDNA3.1-TRβΔ質(zhì)粒；M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 8 000；B.重組質(zhì)粒pcDNA3.1-TRβΔ及其突變體的Western blot鑒定結(jié)果，1.未轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞；2.pcDNA3.1-TRβΔ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞；3.pcDNA3.1-TRβΔmut1突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞；4.pcDNA3.1-TRβΔmut2突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞

A.Identification of pcDNA3.1-TRβΔ by PCR and double enzyme digestion;1,2.PCR products of pcDNA3.1-TRβΔ;3,4.Products of pcDNA3.1-TRβΔ digested byEcoR Ⅰ andHind Ⅲ;5.Recombinant plasmid pcDNA3.1-TRβΔ;M.DNA Marker DL 8 000；B.Identification of pcDNA3.1-TRβΔ and its mutant by Western blot；1.Empty transfection COS-7 cells;2.COS-7 cells transfected by pcDNA3.1-TRβΔ;3.COS-7 cells transfected by pcDNA3.1-TRβΔmut1;4.COS-7 cells transfected by pcDNA3.1-TRβΔmut2

圖1 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-TRβΔ及其突變體的PCR、雙酶切和Western blot鑒定

Fig.1 Identification of pcDNA3.1-TRβΔ and its mutants by PCR,double enzyme digestion and Western blot

A.重組質(zhì)粒pGL3-Promoter/TRE雙酶切鑒定結(jié)果；1.未酶切的pGL3-Promoter質(zhì)粒；2.未酶切的pGL3-Promoter/TRE質(zhì)粒；3.pGL3-Promoter/TRE質(zhì)粒的XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切產(chǎn)物；4、5.pGL3-Promoter質(zhì)粒的XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切產(chǎn)物；M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 8 000;B.重組質(zhì)粒pGL3-Promoter/TRE測(cè)序鑒定結(jié)果

A.Identification of pGL3-Promoter/TRE by double enzyme digestion；1.Recombinant plasmid pGL3-Promoter;2.Recombinant plasmid pGL3-Promoter/TRE;3.Products of pGL3-Promoter/TRE digested byXhoⅠ andXbaⅠ;4,5.Products of pGL3-Promoter digested byXhoⅠ andXbaⅠ;M.DNA Marker DL 8 000;B.Identification of pGL3-Promoter/TRE by sequencing

圖2 重組質(zhì)粒pGL3-Promoter/TRE雙酶切和測(cè)序鑒定

Fig.2 Identification of pGL3-Promoter/TRE by double enzyme digestion and sequencing

A.突變質(zhì)粒pcDNA3.1-TRβΔmut1測(cè)序鑒定結(jié)果；B.突變質(zhì)粒pcDNA3.1-TRβΔmut2測(cè)序鑒定結(jié)果

A.Identification of pcDNA3.1-TRβΔmut1 by sequencing;B.Identification of pcDNA3.1-TRβΔmut2 by sequencing

圖3 突變質(zhì)粒pcDNA3.1-TRβΔmut1和pcDNA3.1-TRβΔmut2測(cè)序鑒定

Fig.3 Identification of pcDNA3.1-TRβΔmut1 and pcDNA3.1-TRβΔmut2 by sequencing

2.5 Western blot鑒定TRβΔ相關(guān)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后的表達(dá)

COS-7細(xì)胞系為TR缺陷型細(xì)胞系，細(xì)胞內(nèi)無TR表達(dá)。而在pcDNA3.1-TRβΔ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的T2組、pcDNA3.1-TRβΔmut1突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的M1組、pcDNA3.1-TRβΔmut2突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的M2組，均可見分子質(zhì)量為55 ku的受體蛋白表達(dá)(圖1B)，證實(shí)以上重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞并開始穩(wěn)定表達(dá)。

2.6 TRβΔ的P-box氨基酸序列與報(bào)告基因表達(dá)增強(qiáng)的關(guān)系及對(duì)T3的響應(yīng)

結(jié)果見表2。檢測(cè)熒光素酶活性后，以上各組的活性差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01) (表2)。與對(duì)照組(CTRL組)相比，T0組由于缺乏與TRβΔ相結(jié)合的TRE序列，其熒光素酶活性變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2 577.33 RLUs/mg±75.83 RLUs/mg VS 292.33 RLUs/mg±27.09 RLUs/mg,P>0.05)，并且加T3前后也無顯著變化(2 577.33 RLUs/mg±75.83 RLUs/mg VS 2 155.33±102.41 RLUs/mg,P>0.05) (表2)。T1組由于缺乏與TRβΔ相結(jié)合的TRE序列，其熒光素酶活性較對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2 5705 RLUs/mg±2 850.78 RLUs/mg VS 292.33±27.09 RLUs/mg,P>0.05)，并且加T3前后也無變化(25 705 RLUs/mg±2 850.78 RLUs/mg VS 30 417.67±743.97 RLUs/mg,P>0.05) (表2)。而在T2組中，盡管同時(shí)存在TRβΔ受體和TRE序列，但在沒有T3的條件下熒光素酶活性較對(duì)照組仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(20 647 RLUs/mg±1 333.93 RLUs/mg VS 292.33 RLUs/mg±27.09 RLUs/mg,P>0.05)；而加入T3后，其活性顯著增加(20 647 RLUs/mg±1 333.93 RLUs/mg VS 295 157 RLUs/mg±16 454.55 RLUs/mg,P<0.01)，同時(shí)也高于CTRL、T0、T1各組(P<0.01) (表2)。M1組中，TRβΔ受體的P-box氨基酸保守序列突變?yōu)镃EGCKG，與TRβ1的P-box序列一致，同時(shí)存在TRE序列，盡管在沒有T3的條件下熒光素酶活性較T2不加T3組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(20 647 RLUs/mg±1 333.93 RLUs/mg VS 48 297.33 RLUs/mg±3 033.69 RLUs/mg,P>0.05)；但加入T3后，其活性也顯著增加(356 915.7 RLUs/mg±27 622.42 RLUs/mg VS 48 297.33 RLUs/mg±3 033.69 RLUs/mg,P<0.01)，同樣高于CTRL、T0、T1各組(P<0.01) (表2)。但是M2組中，P-box氨基酸保守序列突變?yōu)镃GACKG，存在TRE序列，但與CTRL、T0、T1各組和T2不加T3組相比，其熒光素酶活性20 893 RLUs/mg±1924.04 RLUs/mg變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，并且組內(nèi)T3存在與否活性變化也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(20 893 RLUs/mg±1 924.04 RLUs/mg VS 49 628.67 RLUs/mg±2 353.818 RLUs/mg,P>0.05)，此外與M1加T3組相比，M2加T3組熒光素酶活性顯著降低(356 915.7 RLUs/mg±27 622.42 RLUs/mg VS 49 628.67±2 353.818 RLUs/mg,P<0.01) (表2)。以上結(jié)果表明,經(jīng)T3調(diào)節(jié)，在保證P-box氨基酸序列的完整性和保守性的條件下，TRβΔ通過P-box序列與TRE作用后，可增強(qiáng)熒光素酶報(bào)告基因載體的表達(dá)(圖4)。

表2 不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞48 h后熒光素酶活性的檢測(cè)結(jié)果

注：分別與CTRL加和不加T3組、T0加和不加T3組、T1加和不加T3組相比，▲P<0.01；與T2不加T3組相比，▼P<0.01；與M1不加T3組相比，◆P<0.01；與M1加T3組相比，#P<0.01；分別與CTRL加和不加T3組、T0加和不加T3組、T1加和不加T3組相比，△P>0.05；與T2不加T3組相比，▽P>0.05；與M2不加T3組相比，◇P>0.05。

Note:Respectively compared with the CTRL group incubated with and without T3,T0 group incubated with and without T3,T1 group incubated with and without T3,▲P<0.01;Compared with the T2 group incubated without T3,▼P<0.01;Compared with the M1 group incubated without T3,◆P<0.01;Compared with the M1 group incubated with T3,#P<0.01;Respectively compared with the CTRL group incubated with and without T3,T0 group incubated with and without T3,T1 group incubated with and without T3,△P>0.05;Compared with the T2 group incubated without T3,▽P>0.05;Compared with the M2 group incubated without T3,◇P>0.05.

圖4 不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞48 h后熒光素酶活性的檢測(cè)結(jié)果

3 討論

甲狀腺激素受體(TR)是核受體超家族的成員之一，從氨基端到羧基端可分為A-F 6個(gè)區(qū)，組成4個(gè)功能域[5]。首先是氨基端的A/B域，構(gòu)成轉(zhuǎn)錄激活域。在中央的C區(qū)形成DNA結(jié)合域 (DNA-binding domain,DBD)，該結(jié)構(gòu)域通過鋅指結(jié)構(gòu)特異性的識(shí)別靶基因TRE后，再與之結(jié)合。DBD有兩個(gè)特征性結(jié)構(gòu)，即P-box和D-box，P-box決定與受體相互作用的DNA序列的特異性，D-box識(shí)別TRE兩半位的間隔。D區(qū)是含有細(xì)胞核定位信號(hào)的鉸鏈區(qū)。E/F區(qū)形成配體結(jié)合域(ligand-binding domain,LBD)。TR具有高度保守的DNA結(jié)合域和配體結(jié)合域，尤其是DNA結(jié)合域，對(duì)TR識(shí)別TRE序列并開啟轉(zhuǎn)錄激活作用十分重要[6]。

而本實(shí)驗(yàn)室在研究甲狀腺激素受體的過程中新發(fā)現(xiàn)的同功體TRβΔ，與常見的TRβ1受體相比，有108 bp的序列出現(xiàn)在第3和4外顯子之間，然而其讀碼框兩側(cè)并不會(huì)因這些新出現(xiàn)的序列發(fā)生改變，經(jīng)翻譯只是得到比TRβ1多了36個(gè)氨基酸的新受體。然而這36個(gè)氨基酸恰好位于TRβΔ高度保守的P-box之后，使P-box序列變?yōu)镃EGCKP，與經(jīng)典的TRβ1 P-box序列CEGCKG僅在最后一位不同[3]。這種P-box序列發(fā)生變化的TRβΔ受體能否結(jié)合TRE并開啟轉(zhuǎn)錄激活作用，需要本文研究予以證實(shí)。因此成功構(gòu)建pcDNA3.1-TRβΔ真核表達(dá)載體(圖1 A)，可為全面研究TRβΔ功能奠定基礎(chǔ)。

甲狀腺激素受體調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄的前提是受體與TRE結(jié)合。TRE常出現(xiàn)在靶基因啟動(dòng)子區(qū)域上游，并由若干個(gè)半位元件組成。半位元件序列通常為(G/A)GGT(C/G)A，比較保守[7]。起正調(diào)控作用的TRE最少包含兩個(gè)TRE半位元件，并且有3種重復(fù)形式。一種為同向重復(fù)，序列：AGGTCANNNNAGGTCA。一種為反向回文序列，序列：TGACCTNNNNNNAGGTCA[8]。一種為回文序列：AGGTCATGACCT，該種類型的TRE與受體結(jié)合后，可產(chǎn)生極強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄激活作用。因此，本研究采用基因突變的方式，將回文序列的TRE插入到熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-Promoter的啟動(dòng)子區(qū)域，當(dāng)TRβΔ受體與TRE結(jié)合后，即可激活下游的熒光素酶表達(dá)。試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)pGL3-Promoter/TRE報(bào)告基因載體構(gòu)建成功(圖2)。

研究表明TRβ受體家族的DBD第1個(gè)鋅指C末端的P-box序列非常保守，蛋白序列通常為CEGCKG。序列的必需氨基酸框架為·EG··G，其中E為第1氨基酸，G為第2氨基酸、第2個(gè)G為第3氨基酸，第1、2位的EG最為重要，而第3位的G則次之[9]。例如TRβ1的P-box序列即為CEGCKG，可正常結(jié)合TRE序列[10]。而比TRβ1多36個(gè)氨基酸的TRβΔ P-box序列為CEGCKP，恰好在第3位氨基酸有所不同。但是pGL3-Promoter/TRE與pcDNA3.1-TRβΔ兩種重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染TR缺陷型細(xì)胞系COS-7后，試驗(yàn)結(jié)果表明在T3的調(diào)節(jié)下，TRβΔ正常與TRE結(jié)合，隨后激活了熒光素酶基因的表達(dá)，導(dǎo)致酶活性大大增加(表2和圖4)。而缺少TRβΔ或TRE序列，則無法激活報(bào)告基因的表達(dá)(表2和圖4)。這種現(xiàn)象說明盡管第3位的G比較重要，但在不能換成較大側(cè)鏈氨基酸的前提下，更換為其他氨基酸后依然能與TRE正常結(jié)合[11]。也初步證明TRβΔ受體是受T3調(diào)節(jié)的功能性的甲狀腺激素新受體。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證P-box序列的完整性對(duì)于TR受體結(jié)合TRE后所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄激活作用的重要性，本文接下來構(gòu)建pcDNA3.1-TRβΔmut1突變質(zhì)粒，將TRβΔ的P-box序列由CEGCKP突變?yōu)镃EGCKG，使其與TRβ1保持一致 (圖3A)。其次構(gòu)建pcDNA3.1-TRβΔmut2突變質(zhì)粒，其P-box序列由CEGCKP變?yōu)镃GACKG，完全改變序列原有的保守性(圖3 B)。當(dāng)pGL3-Promoter/TRE與pcDNA3.1-TRβΔmut1共轉(zhuǎn)染后，試驗(yàn)結(jié)果表明在T3的調(diào)節(jié)下，保持P-box序列完整性的TRβΔmut1可與TRE正常結(jié)合，激活熒光素酶基因的表達(dá) (表2和圖4)。而pGL3-Promoter/TRE與pcDNA3.1-TRβΔmut2共轉(zhuǎn)染后，嚴(yán)重破壞P-box序列完整性的TRβΔmut2無法與TRE正常結(jié)合，熒光素酶基因的表達(dá)大大降低 (表2和圖4)。結(jié)果再一次驗(yàn)證P-box序列中EG不可改變，其決定TR與DNA序列結(jié)合的特異性。如果發(fā)生改變，則TRβ受體DNA結(jié)合能力受到影響[12]，從而可能喪失轉(zhuǎn)錄激活功能，而第3位氨基酸G則可有限制的代替。本文試驗(yàn)結(jié)果闡明TR受體的P-box序列與受體轉(zhuǎn)錄激活作用密切相關(guān)。最終證明TRβΔ通過完整和保守的P-box氨基酸序列，在T3的調(diào)節(jié)下正常與TRE結(jié)合后，產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄激活作用；TRβΔ是有轉(zhuǎn)錄因子性質(zhì)的功能性TR。

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Relationship between P-box Amino Acid Sequence of Novel Thyroid Hormone Receptor βΔ and Transcription Activation

XIE Wei1，ZHAO Rong-lan2，ZUO Ai-jun2，LIANG Dong-chun2，SUN Bei2，GUO Gang2，ZHANG Jing-yu2

(1.BiomedicineResearchCenterofBaotouMedicalCollege,Baotou,InnerMongolia,014040,China；2.KeyLaboratoryofHormonesandGrowthoftheMinistryofHealth,EndocrinologyResearchInstituteofMetabolicDiseaseHospitalofTianjinMedicalUniversity,Tianjin,300070,China)

To study the transcription activation of a novel thyroid hormone receptor isoform TRβΔ with the binding of thyroid hormone response element (TRE) and P-box amino acid sequence,and to reveal the relationship between the transcription activation of TRβΔ and the conservation of P-box sequence,and whether TRβΔ had the characteristics of transcription factor.The recombinant eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1-TRβΔ was constructed.To mutate the P-box DNA sequence of TRβΔ,the mutation plasmids pcDNA3.1-TRβΔmut1 and pcDNA3.1-TRβΔmut2 were constructed.Above plasmids were transiently co-transfected into COS-7 cells with different groups.The cells in different groups were treated with or without T3 respectively,and then the activity of luciferase was detected.All the plasmids were successfully constructed,which was confirmed by PCR,double enzyme digestion and sequencing.Compared with the TRβ1,P-box sequence of TRβΔ was different in the last one site,but TRβΔ complied with the conservation of P-box sequence.TRβΔ had the transactivation effect on the reporter gene through binding with TRE,and luciferase activity increased significantly with T3 (P<0.01).The pcDNA3.1-TRβΔmut1 which was consistent with P-box sequence of TRβ1 via mutation,might significantly improve the expression of luciferase with T3 (P<0.01).The pcDNA3.1-TRβΔmut2 which completely destroyed the P-box sequence via mutation,might significantly decrease the expression of luciferase when compared with TRβΔ (P<0.01).The results showed that with the binding of the conservative P-box sequence and TRE,TRβΔ had the effect of the transcription activation under the regulation of T3. TRβΔ has the characteristics of a transcription factor.

thyroid hormone receptor isoform TRβΔ；thyroid hormone response element；P-box amino acid sequence；transcription activation

2016-06-21

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81550038)；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015BS0807，2015BS0801)；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)校科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(NJZY16207)；包頭醫(yī)學(xué)院科學(xué)研究基金項(xiàng)目(BYJJ-YF 201606)；包頭醫(yī)學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(BSJJ201623，BSJJ201632)

謝 偉(1985-)，男，內(nèi)蒙古包頭人，博士，講師，主要從事生物醫(yī)學(xué)工程專業(yè)研究工作。*通訊作者

S852.21

A

1007-5038(2017)03-0089-08