郭佳奇，王瑞瑞，劉清雙，張培培，楊麗娟

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，大慶 163319）

植物乳桿菌粉發(fā)酵玉米秸稈條件優(yōu)化

郭佳奇，王瑞瑞，劉清雙，張培培，楊麗娟

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，大慶 163319）

以植物乳桿菌為實(shí)驗(yàn)菌種并進(jìn)行凍干處理，將凍干菌粉加入玉米秸稈中進(jìn)行青貯發(fā)酵，以粗蛋白為指標(biāo)對(duì)發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行判定。以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)酵時(shí)間10 d，發(fā)酵溫度30℃，接種量1%為基礎(chǔ)進(jìn)行響應(yīng)面分析確定最優(yōu)發(fā)酵條件，通過實(shí)驗(yàn)測(cè)得優(yōu)化后的粗蛋白含量為11.71%，與預(yù)測(cè)值11.85%非常接近。

植物乳桿菌；農(nóng)作物廢棄物；響應(yīng)面

我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，農(nóng)作物廢棄物產(chǎn)量巨大，目前對(duì)于秸稈等農(nóng)作物的利用主要以加工青貯飼料為主[1]。將乳酸菌加入到青貯飼料中可以顯著提高其乳酸的含量以及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[2]。植物乳桿菌是農(nóng)作物秸稈發(fā)酵的重要菌種，其凍干菌粉可以直接應(yīng)用于秸稈發(fā)酵，和液態(tài)菌種相比此種菌粉便于保存，質(zhì)量穩(wěn)定，用法簡(jiǎn)單適用于家庭及不同規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。旨在研制一種高活性凍干菌粉及應(yīng)用工藝，為農(nóng)作物廢棄物發(fā)酵青貯飼料的生產(chǎn)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

脫脂乳、維生素C、甘油、干玉米秸稈、植物乳桿菌（本實(shí)驗(yàn)室保藏）[3-5]

1.2 生產(chǎn)工藝

1.3 試驗(yàn)方法

秸稈發(fā)酵液制備；篩選玉米秸稈，顏色白中帶黃，無腐敗和霉變。秸稈切成長(zhǎng)度1～2 cm的小段，將莖稈和葉子碎片混合均勻，并放入陶瓷發(fā)酵缸中（5 kg·缸-1），加水（5 L·缸-1），按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入相應(yīng)比例的凍干菌粉制備秸稈發(fā)酵液。

1.3.1 凍干菌劑制備

1.3.1.1 菌體的培養(yǎng)及收集

植物乳桿菌37℃條件下在MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，再以4 000 r·min-1的條件將菌液離心20 min[7]。1.3.1.2復(fù)合保護(hù)劑制備

維生素C采用膜孔徑為0.22 μm的濾菌器除菌[8-9]，脫脂乳在115℃下保溫15 min殺菌，純甘油121℃，15 min滅菌。按比例配置復(fù)合保護(hù)劑，即脫脂乳∶甘油：Vc=13.68%∶1.97%：0.20%[10]。

1.3.1.3 保護(hù)劑添加

將菌體離心后加入10 mL復(fù)合保護(hù)劑，將保護(hù)劑含菌量調(diào)整至1010cfu·mL-1[11]。

1.3.1.4 制備植物乳桿菌粉

1 mL植物乳桿菌菌懸液分裝進(jìn)無菌帶塞的玻璃瓶中，超低溫冰箱中-40℃下預(yù)凍8 h，真空凍干機(jī)中1 Pa，-45℃下干燥24 h[12]，-5℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 玉米秸稈發(fā)酵單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵秸稈中粗蛋白含量的影響

將植物乳桿菌凍干菌粉以質(zhì)量比0.5%接種量直接加入秸稈發(fā)酵液中，30℃密封培養(yǎng)，每間隔5 d測(cè) 1次發(fā)酵秸稈的蛋白質(zhì)含量。

1.3.2.2 不同發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵秸稈中粗蛋白含量的影響

將植物乳桿菌凍干菌粉以質(zhì)量比0.5%的接種量直接加入秸稈發(fā)酵液中，發(fā)酵液溫度設(shè)置為0～60℃7個(gè)梯度，在發(fā)酵10 d時(shí)分別測(cè)定7組陶瓷發(fā)酵缸中發(fā)酵液的蛋白質(zhì)含量，確定最佳發(fā)酵溫度。

1.3.2.3 不同接種量對(duì)發(fā)酵秸稈中粗蛋白含量的影響

將發(fā)酵溫度設(shè)定為30℃，分別以質(zhì)量比0.5%～3.5%7個(gè)梯度的接種量向發(fā)酵液中直接加入植物乳桿菌凍干菌粉，發(fā)酵10 d時(shí)測(cè)定發(fā)酵秸稈粗蛋白含量，從而確定最佳接種量。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)確定最佳發(fā)酵條件

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度和接種量進(jìn)行優(yōu)化。以發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度和接種量為自變量，以發(fā)酵液中粗蛋白含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)中心組合試驗(yàn)[13-14]。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)中各因素的設(shè)定Table 1Factors of the response surface test

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 凍干菌粉復(fù)水處理

向冷凍干燥后的菌粉中加入與冷凍干燥前等體積的無菌水，水浴鍋中30℃振蕩融化10 min，制備成菌懸液[15]。

1.4.2 凍干菌粉存活率及含菌量的測(cè)定

菌粉存活率測(cè)定方法：采用平板菌落計(jì)數(shù)法于分別測(cè)定冷凍干燥前后活菌數(shù)量，計(jì)算存活率。培養(yǎng)條件為37℃培養(yǎng)48 h。

凍干菌粉含菌量（cfu·g-1）=凍干菌粉存活率× 1010（cfu·mL-1）×10 mL/凍干后菌粉質(zhì)量（g）

1.4.3 發(fā)酵秸稈中粗蛋白含量的測(cè)定方法

粗蛋白（CP）用GB64322-86法[16]

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)秸稈發(fā)酵過程中粗蛋白含量的影響

按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在不同的時(shí)間點(diǎn)對(duì)發(fā)酵液中粗蛋白含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示隨著發(fā)酵時(shí)間的增加發(fā)酵秸稈中粗蛋白含量先上升后下降，發(fā)酵到10 d時(shí)，粗蛋白含量達(dá)到最大值。隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，粗蛋白含量有所下降。

圖1 不同時(shí)間對(duì)發(fā)酵液中粗蛋白含量的影響Fig.1Effect of the different fermentation time on the content of crude protein

2.2 發(fā)酵溫度對(duì)秸稈發(fā)酵過程中粗蛋白含量的影響

以植物乳桿菌凍干菌粉為試驗(yàn)材料，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著溫度的增加，粗蛋白含量隨溫度的改變有明顯變化，當(dāng)發(fā)酵溫度為30℃時(shí)，發(fā)酵液中粗蛋白含量達(dá)到最大值。隨著發(fā)酵溫度的升高，植物乳桿菌活性提高，發(fā)酵液中粗蛋白含量升高，而過高的發(fā)酵溫度易使菌體失活，所以粗蛋白含量呈先升后降的趨勢(shì)。試驗(yàn)結(jié)果顯示30℃為較佳發(fā)酵溫度。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)粗蛋白含量的影響Fig.2Effect of the fermentation temperature on the content of crude protein

2.3 接種量對(duì)秸稈發(fā)酵過程中粗蛋白含量的影響

以植物乳桿菌凍干菌粉為試驗(yàn)材料，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著接種量的不斷增加發(fā)酵秸稈中粗蛋白的含量先升后降，由圖可知當(dāng)接種量為1%時(shí)，發(fā)酵秸稈的粗蛋白含量達(dá)到最大值。

圖3 接種量對(duì)蛋白質(zhì)含量的影響Fig.3Effect of the inoculation amount on the content of crude protein

2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化最佳保護(hù)劑配比

以單因素試驗(yàn)的最佳值為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)。響應(yīng)面試驗(yàn)的各水平值及試驗(yàn)結(jié)果如表1和表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2Results of the response surface test

以粗蛋白含量Y1為因變量，因素X1，X2，X3為自變量的回歸方程為：

Y1=11.922 32-2.228 803*X1X1-0.849 943*X2X2-0.761 555*X3X3

用F檢驗(yàn)評(píng)價(jià)方程，得到概率水平在99%的條件下回歸是顯著的（P＜0.000 134）。方程的確定系數(shù)R2=92.79%，說明這個(gè)方程可以解釋92.79%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。圖1～3是方程的響應(yīng)面圖，證實(shí)了擬合面有真實(shí)的最大值。

軟件計(jì)算結(jié)果為，接種量1.0062%，時(shí)間10.3156d，溫度30.359 5℃時(shí)，發(fā)酵秸稈的粗蛋白最大含量為11.85%。為了對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，在這個(gè)點(diǎn)做重復(fù)實(shí)驗(yàn)，通過3次實(shí)驗(yàn)求得平均值，發(fā)酵秸稈粗蛋白平均含量為11.71%。與試驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)得到的粗蛋白含量最大值吻合，說明優(yōu)化得到的響應(yīng)面模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合的較好。

圖4 發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵溫度交互作用對(duì)粗蛋白含量的影響的響應(yīng)面圖Fig.4The response surface graph of the effect of the interactions between time and temperature on the content of crude protein

3 結(jié)論

采用添加微生物制劑加青貯飼料，提高了玉米秸稈粗飼料的使用量和利用率，節(jié)約飼料糧，解決了人畜爭(zhēng)糧矛盾。采用冷凍干燥后的乳酸菌粉發(fā)酵秸稈，操作簡(jiǎn)便，適用于不同的發(fā)酵規(guī)模。發(fā)酵玉米秸稈中粗蛋白的含量是評(píng)價(jià)發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的主要指標(biāo)[17]。以粗蛋白為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)玉米秸稈發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，找到最佳發(fā)酵組合，提高農(nóng)作物廢棄物的利用率。王汝富曾用發(fā)酵活干菌處理秸稈，其粗蛋白質(zhì)含量提高2.4%，飼喂肉牛日增重提高73.5%[18]。劉圈煒等[19]在青貯玉米秸稈中添加復(fù)合乳酸菌制劑，試驗(yàn)組乳酸含量和蛋白質(zhì)含量均顯著提高。試驗(yàn)采用植物乳桿菌粉發(fā)酵玉米秸稈并對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化得到的最佳發(fā)酵條件為接種量為1.006 2%，時(shí)間為10.315 6天，溫度為30.359 5℃時(shí)，得到最大蛋白質(zhì)含量11.71%。試驗(yàn)結(jié)果與武安泉[20]得出的最優(yōu)發(fā)酵溫度20℃有較大差異，分析原因可能是由于所用菌種不同以及試驗(yàn)才采用凍干菌粉需要較高溫度提高菌體活性所致。

圖5 發(fā)酵時(shí)間與接種量交互作用對(duì)粗蛋白含量的影響的響應(yīng)面圖Fig.5The response surface graph of the effect of the interactions between time and inoculation amount on the content of crude protein

圖6 發(fā)酵溫度與接種量交互作用對(duì)蛋白質(zhì)含量的影響的響應(yīng)面圖Fig.6The response surface graph of the effect of the interactions between fermentation temperature and inoculation amount on the content of crude protein

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Optimization of Fermentation Condition for Maize Straw by Lactobacillus Plantarum

Guo Jiaqi，Wang Ruirui，Liu Qingshuang，Zhang Peipei，Yang Lijuan
（College of Agronomy，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

Lactobacillus plantarum was used as experiment strains and the freeze-drying powder was added to maize straw for silage fermentation，the content of crude protein was tested as an indicator to determine the fermentation results.In univariate results fermentation time 10 d，fermentation temperature 30℃，inoculation 1%as the basis to response surface analysis for determining optimum fermentation conditions，as measured by the protein content of experimental optimized for 11.71%，very close to predicted value 11.85%.

Lactobacillus plantarum；agricultural waste；response surface

S816.53

A

1002-2090（2017）01-0017-05

2015-06-18

資金項(xiàng)目：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（xc2014072）。

郭佳奇（1995-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院環(huán)境科學(xué)專業(yè)2013級(jí)本科生。

楊麗娟，女，實(shí)驗(yàn)師，E-mail：591287113@qq.com。