詹林盛

·專家述評(píng)·

輸血及細(xì)胞治療的可視化評(píng)價(jià)技術(shù)研究*

詹林盛

輸血 細(xì)胞治療 可視化檢測(cè)

輸血醫(yī)學(xué)已正式成為我國(guó)臨床醫(yī)學(xué)二級(jí)學(xué)科，對(duì)輸血醫(yī)學(xué)科研能力和水平提出了更高的要求，輸血醫(yī)學(xué)科研工作已成為輸血醫(yī)學(xué)學(xué)科發(fā)展的內(nèi)在動(dòng)力。近年來我國(guó)輸血科研工作取得了顯著的成績(jī)，但與其他學(xué)科相比，還有一定的差距。如何培育輸血醫(yī)學(xué)新的增長(zhǎng)點(diǎn)是廣大輸血醫(yī)學(xué)科研工作者需要思考的問題。當(dāng)今生命科學(xué)研究從以免疫學(xué)、分子生物學(xué)為主導(dǎo)的經(jīng)典科學(xué)向前沿學(xué)科、高新技術(shù)相交叉融合的方向拓展，可視醫(yī)學(xué)、大數(shù)據(jù)、云計(jì)算等已開始應(yīng)用于生命科學(xué)研究領(lǐng)域，也將加速推進(jìn)輸血醫(yī)學(xué)科學(xué)研究取得新進(jìn)展。

近年來新型納米生物技術(shù)取得快速發(fā)展，在病原診斷、藥物遞送、成像示蹤等方面顯示出良好的應(yīng)用前景。而多模式分子影像技術(shù)集成光學(xué)成像（BLI）、電子計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）、核磁共振（MRI）等互為補(bǔ)充，適用于對(duì)輸血感染及輸血免疫反應(yīng)進(jìn)行可視化監(jiān)測(cè)，并可對(duì)活體內(nèi)過繼性免疫細(xì)胞跨組織器官遷移以及分子細(xì)胞組織器官整體多層次的功能信息進(jìn)行表征，兼具實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)、無創(chuàng)的特點(diǎn)，獲取結(jié)果客觀準(zhǔn)確，解析度高、分辨率高，可為輸血醫(yī)學(xué)臨床轉(zhuǎn)化提供科學(xué)性強(qiáng)的理論依據(jù)。

1 血液病原安全快速可視化檢測(cè)技術(shù)研究 隨著核酸篩查技術(shù)（NAT）的推廣應(yīng)用，平時(shí)常規(guī)血液病原感染安全性得到極大的提升，但在突發(fā)事件以及野戰(zhàn)條件下，會(huì)集中出現(xiàn)大量傷員，需血量大、時(shí)間緊迫，往往需要臨時(shí)征集血液，也需要對(duì)獻(xiàn)血者進(jìn)行血液病原體快速篩查，此時(shí)血液安全性問題依然面臨挑戰(zhàn)。因此，發(fā)展簡(jiǎn)便、快速且具有高靈敏度和高選擇性的血液可視化檢測(cè)方法具有以下重要意義：①實(shí)現(xiàn)了新型熒光納米材料的可控合成、性質(zhì)表征、生物學(xué)修飾，完成了基于金納米棒狀材料的免疫傳感器的構(gòu)建：該免疫傳感器對(duì)乙肝表面抗原標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有高靈敏度，由于采用的物理修飾模式較好地提高了免疫探針的環(huán)境適應(yīng)性，使其能在多種復(fù)雜的生理介質(zhì)中檢測(cè)血液傳染病標(biāo)志物[1]；②建立了切刻內(nèi)切酶介導(dǎo)、分子信標(biāo)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，優(yōu)化了擴(kuò)增條件，目前兩種等溫?cái)U(kuò)增方法對(duì)于細(xì)菌質(zhì)粒的檢測(cè)下限均達(dá)到皮摩爾量級(jí)；并構(gòu)建了核酸層析檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)，可對(duì)核酸擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行快速可視化判讀，已開展了血小板中多種污染菌基因組的檢測(cè)[2]；③建立了基于金納米棒團(tuán)聚性質(zhì)的快速核酸傳感器，優(yōu)化了檢測(cè)模式；該核酸探針對(duì)合成目的序列顯示了良好的特異性、較高的靈敏度和較寬的動(dòng)態(tài)范圍[3]。

2 輸血傳染病感染及炎癥的分子成像研究 由于缺乏合適的研究體系，目前整體水平上對(duì)輸血相關(guān)病原（HBV/HCV）感染和宿主免疫系統(tǒng)的反應(yīng)，在同一時(shí)間和空間的連續(xù)動(dòng)態(tài)變化還缺乏深入了解，將病毒感染與免疫系統(tǒng)的反應(yīng)作為一個(gè)真正的系統(tǒng)進(jìn)行可視化研究還面臨著挑戰(zhàn)，因而阻礙了對(duì)輸血相關(guān)病原感染、復(fù)制及其免疫逃逸、免疫清除機(jī)制等本質(zhì)問題的深入研究。針對(duì)此問題，應(yīng)充分發(fā)揮生物發(fā)光和化學(xué)熒光等多模式光學(xué)成像技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，在模型動(dòng)物水平同時(shí)針對(duì)病毒基因組和宿主免疫系統(tǒng)兩個(gè)方面，構(gòu)建多靶點(diǎn)、多功能分子探針（報(bào)告基因），進(jìn)行病毒、宿主天然免疫信號(hào)分子以及免疫細(xì)胞等多個(gè)靶點(diǎn)的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)識(shí)別與示蹤，實(shí)現(xiàn)病原與宿主免疫系統(tǒng)相互作用的多模式分子成像。在此基礎(chǔ)上開展基于分子影像的抗感染藥物篩選和疫苗評(píng)價(jià)，以及輸血相關(guān)肝炎病毒致病機(jī)制研究。該研究有望進(jìn)一步從整體層面上闡明輸血相關(guān)肝炎病毒免疫逃逸或免疫清除的分子機(jī)制，為輸血相關(guān)感染的防治研究提供基礎(chǔ)平臺(tái)。

2.1 輸血相關(guān)肝炎病毒基因組標(biāo)記示蹤：建立了小動(dòng)物尾靜脈和眼底靜脈叢水動(dòng)力基因肝臟快速轉(zhuǎn)染技術(shù)[4]，以熒光素酶（Luc）為報(bào)告基因標(biāo)記HBV/HCV基因組，基于水動(dòng)力轉(zhuǎn)染技術(shù)和噬菌體整合酶體系，建立了系列報(bào)告基因標(biāo)記的可視化HBV/HCV功能基因組小鼠體內(nèi)表達(dá)體系[5-9]：包括HBV啟動(dòng)子調(diào)控?zé)晒馑孛副磉_(dá)小鼠模型，報(bào)告基因標(biāo)記的HBV全基因組表達(dá)小鼠模型，HCV IRES介導(dǎo)Luc表達(dá)小鼠模型、HCV核心蛋白-Luc融合表達(dá)小鼠模型、報(bào)告基因標(biāo)記的HCV全基因組小鼠體內(nèi)長(zhǎng)期表達(dá)模型，以及基于熒光素酶重組與互補(bǔ)原理建立HCV NS3/4A蛋白酶細(xì)胞和小鼠體內(nèi)檢測(cè)體系等，結(jié)合小動(dòng)物活體熒光成像技術(shù)，實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)HBV/HCV功能基因在小鼠體內(nèi)的表達(dá)。進(jìn)而基于該模型體系開展病毒性肝炎慢性化進(jìn)程和致肝細(xì)胞損傷過程中的作用機(jī)制研究，以及抗病毒藥物和疫苗的體內(nèi)可視化篩選和評(píng)價(jià)，有助于促進(jìn)獻(xiàn)血者隱匿性肝炎病毒感染及輸血相關(guān)病毒性肝炎的防治研究。

2.2 輸血相關(guān)病原感染引起機(jī)體炎癥信號(hào)分子變化的可視化研究：針對(duì)機(jī)體炎癥信號(hào)分子以及天然免疫關(guān)鍵信號(hào)分子，構(gòu)建以Fluc為報(bào)告基因表達(dá)載體，建立輸血相關(guān)病原感染引發(fā)的系列肝臟炎癥信號(hào)分子在模型動(dòng)物體內(nèi)實(shí)時(shí)可視化監(jiān)測(cè)的新方法[10-13]。包括一種基于熒光素酶定量分析肝炎病毒與宿主蛋白質(zhì)相互作用的新方法及其應(yīng)用；病毒感染引發(fā)肝臟細(xì)胞凋亡的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)技術(shù)；病原感染及肝臟再生過程中肝臟NF-κB活體成像監(jiān)測(cè)技術(shù)；以及病毒逃逸機(jī)體免疫監(jiān)視過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的IFN-β可視化示蹤成像技術(shù)等?；谏鲜鲅装Y及天然免疫信號(hào)分子可視化監(jiān)測(cè)體系，闡明部分輸血相關(guān)病原感染及致病的免疫學(xué)機(jī)制，為抗病毒免疫治療臨床前評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)平臺(tái)。

3 輸血免疫反應(yīng)的分子成像研究 除常見的溶血反應(yīng)、感染、非特異性發(fā)熱反應(yīng)等，儲(chǔ)存紅細(xì)胞和儲(chǔ)存血小板輸注的不良反應(yīng)及其機(jī)制成為目前輸血安全研究的熱點(diǎn)。在儲(chǔ)存過程中紅細(xì)胞代謝、形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理功能和生化指標(biāo)等方面均發(fā)生不同程度的改變，這些系列變化稱為紅細(xì)胞“儲(chǔ)存損傷”，與嚴(yán)重感染、多器官功能障礙、心血管事件發(fā)生、輸血相關(guān)急性肺損傷、死亡率增加等不良反應(yīng)密切相關(guān)。因此，加強(qiáng)輸血相關(guān)免疫反應(yīng)的發(fā)病機(jī)制及防治措施研究，是當(dāng)前輸血不良反應(yīng)防治研究中的重要命題。通過構(gòu)建系列可視化感染與炎癥小動(dòng)物模型，結(jié)合分子影像技術(shù)，探討儲(chǔ)存紅細(xì)胞、血小板輸注引發(fā)輸血不良免疫反應(yīng)的效應(yīng)及其作用機(jī)制[14，15]，已開展如下研究：①分子成像監(jiān)測(cè)輸注儲(chǔ)存血液誘發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)：建立了系列細(xì)菌感染的可視化模型，以及炎癥分子（SAA、TNF-α、IL-6等）可視化小動(dòng)物模型，比較新鮮血液和保存時(shí)間較長(zhǎng)的血液輸注對(duì)戰(zhàn)創(chuàng)傷預(yù)后的影響，闡明了儲(chǔ)存RBCs輸注對(duì)細(xì)菌感染誘導(dǎo)肝損傷的部分作用機(jī)制。②分子成像監(jiān)測(cè)輸血相關(guān)急性肺損傷：建立報(bào)告基因標(biāo)記的肺臟炎癥信號(hào)分子（IL-6、NF-κB、TNF-α等）轉(zhuǎn)基因小鼠模型，通過“二次打擊”誘發(fā)輸血相關(guān)急性肺損傷，結(jié)合活體分子影像學(xué)，闡述TRALI發(fā)生后的機(jī)體氧化應(yīng)激、炎癥因子隨時(shí)間和空間的連續(xù)動(dòng)態(tài)變化，及其與肺組織炎癥反應(yīng)的相關(guān)性，有助于推測(cè)疾病轉(zhuǎn)歸及預(yù)后情況。③分子成像監(jiān)測(cè)輸血相關(guān)GVHD：輸血相關(guān)GVHD發(fā)生的一個(gè)重要因素就是供者免疫效應(yīng)細(xì)胞發(fā)生過度活化和急劇分裂增殖；通過對(duì)供者免疫細(xì)胞的熒光標(biāo)記，利用多模式成像實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)供者免疫效應(yīng)細(xì)胞呈現(xiàn)的時(shí)間和空間上的程序性遷移、聚集和活化與GVHD發(fā)生的關(guān)系，為深入闡明輸血相關(guān)GVHD的發(fā)生機(jī)制及防治措施的研究提供模型基礎(chǔ)。

4 細(xì)胞治療的體內(nèi)成像示蹤研究 由于技術(shù)限制，目前有關(guān)腫瘤細(xì)胞治療研究更多關(guān)注于療效的觀察，而對(duì)于外源輸注的細(xì)胞是否有效歸巢于病灶或目標(biāo)臟器和淋巴器官，以及是否可實(shí)現(xiàn)與其所調(diào)控下游細(xì)胞共定位，這其中又有哪些趨化因子或細(xì)胞因子參與了過繼性輸注細(xì)胞的遷移和歸巢過程等，這些問題目前還沒有明確的答案，特別是對(duì)于過繼性輸注細(xì)胞和被調(diào)控細(xì)胞亞群在同一時(shí)間和空間的連續(xù)動(dòng)態(tài)變化還缺乏深入了解。本研究結(jié)合化學(xué)熒光和生物發(fā)光等多種分子影像學(xué)技術(shù)，分別對(duì)腫瘤細(xì)胞和過繼性輸注的免疫細(xì)胞進(jìn)行熒光探針或報(bào)告基因標(biāo)記，在臨床前小動(dòng)物水平，開展了腫瘤體內(nèi)增殖轉(zhuǎn)移及過繼性細(xì)胞體內(nèi)遷移示蹤研究。結(jié)果顯示體外納米材料等修飾或預(yù)處理的免疫細(xì)胞或干細(xì)胞在體內(nèi)的遷移分布規(guī)律發(fā)生明顯的變化，機(jī)制主要是通過調(diào)控免疫細(xì)胞表面趨化因子受體的表達(dá)水平和細(xì)胞骨架的組織結(jié)構(gòu)等，促進(jìn)其向特定組織遷移和歸巢能力，進(jìn)而影響抗腫瘤或抗感染的作用效果[16，17]。本研究建立的小動(dòng)物活體光學(xué)成像技術(shù)平臺(tái)，成像反應(yīng)靈敏、操作簡(jiǎn)單、數(shù)據(jù)精確，可廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究多個(gè)領(lǐng)域，特別是通過對(duì)輸注細(xì)胞的在體三維立體成像動(dòng)態(tài)示蹤觀察，可以在了解其分布特征的基礎(chǔ)上，合理運(yùn)用分子生物學(xué)或某些化學(xué)藥物對(duì)過繼性輸注細(xì)胞的遷移模式進(jìn)行定向誘導(dǎo)和干涉，進(jìn)而使其發(fā)揮功能最大化。

總之，通過開發(fā)多元化的納米和熒光分子探針，建立基于新型納米材料的病原檢測(cè)技術(shù)；結(jié)合小動(dòng)物活體影像技術(shù)，發(fā)展時(shí)空分辨、高通量、高靈敏度的成像示蹤技術(shù)平臺(tái)，建立輸血相關(guān)傳染病感染及炎癥的分子成像監(jiān)測(cè)體系，實(shí)時(shí)示蹤輸血免疫反應(yīng)的過程，繪制血細(xì)胞（紅細(xì)胞、血小板）及免疫細(xì)胞在體內(nèi)遷移、分布、歸巢聚集圖譜，揭示輸血影響細(xì)胞治療效應(yīng)的作用機(jī)制，輸血及細(xì)胞治療的可視化評(píng)價(jià)技術(shù)平臺(tái)可以為新型輸血治療及過繼性免疫細(xì)胞治療的開發(fā)和臨床轉(zhuǎn)化提供參考和相關(guān)技術(shù)服務(wù)。

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R457.1

A

1671-2587（2017）06-0537-03

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.06.001

*本課題受國(guó)家自然科學(xué)基金（No.81371806，30972615）資助

100850 北京，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所

詹林盛（1971–），男，研究員，博士，主要從事輸血免疫及細(xì)胞治療研究，（E-mail）lszhan91@yahoo.com。

2017-09-27）

（本文編輯：王虹）