于金蕾 朱振來 張?jiān)聫?qiáng) 張 晨 李 巍

·論著·

腸道菌群代謝產(chǎn)物IAID對(duì)特應(yīng)性皮炎小鼠模型的作用

于金蕾 朱振來 張?jiān)聫?qiáng) 張 晨 李 巍

目的： 確定腸道菌群代謝產(chǎn)物吲哚-3-甲醛(IAID，indole-3-carboxaldehyde)在特應(yīng)性皮炎(AD)小鼠模型中的作用。方法： 將C57小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和IAID組。小鼠雙耳外涂卡泊三醇(MC903)制備AD模型，IAID組給予65 μg/kg IAID灌胃，模型組灌等體積DMSO作為對(duì)照，對(duì)照組不處理。10天后肉眼觀察大體炎癥情況，千分尺測(cè)量小鼠耳廓厚度，ELISA法檢測(cè)小鼠血清中總IgE水平并通過RT-PCR的方法檢測(cè)全皮中IL4，IL5，IL6，IL13，IL33，TSLP的表達(dá)。結(jié)果： IAID組小鼠與模型組相比大體炎癥明顯減輕，血清總IgE水平明顯降低(P<0.001)，皮損IL13、TSLP的mRNA水平也顯著下降(P<0.05)。結(jié)論： 腸道菌群代謝產(chǎn)物IAID可以緩解AD小鼠模型的皮膚炎癥。

特應(yīng)性皮炎； 吲哚-3-甲醛； 腸道菌群

特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis，AD)是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，其發(fā)病機(jī)制受諸多因素的調(diào)控[1]。研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群的代謝與過敏性疾病密切相關(guān)，色氨酸為腸道菌群提供所需氮源，IAID是色氨酸的一種重要的吲哚類代謝產(chǎn)物,在過敏性疾病中,腸道菌群代謝色氨酸障礙，導(dǎo)致包括AD在內(nèi)的過敏性疾病患者血液中色氨酸的濃度增高，而色氨酸代謝被抑制[2]。然而，IAID作為腸道菌群的一種重要代謝產(chǎn)物在AD的發(fā)生發(fā)展中扮演什么樣的角色并不清楚。本研究利用AD小鼠模型，研究腸道菌群代謝產(chǎn)物IAID對(duì)AD皮膚炎癥的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物全部為C57小鼠，來自第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心，所有小鼠均為SPF級(jí)別，并在第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行SPF級(jí)別環(huán)境飼養(yǎng)，小鼠飼料均為SPF級(jí)別。

1.2 主要試劑與藥物 二甲基亞砜(DMSO)為美國Sigma公司出品，吲哚-3-甲醛(IAID)來自日本TCI公司，Trizol和SuperScript II反轉(zhuǎn)錄試劑盒為日本Takara公司產(chǎn)品，Taq PCR Master Mix北京天為時(shí)代科技技術(shù)有限公司產(chǎn)品。Elisa試劑盒來自上海星科生物有限公司。

1.3 AD動(dòng)物模型建立 將15只8周齡雌性C57小鼠隨機(jī)分為三組：對(duì)照組，模型組，IAID組，每天于模型組和IAID組小鼠雙耳處均勻涂抹2 nm MC903連續(xù)涂抹10天進(jìn)行造模[3]，并于實(shí)驗(yàn)前2天起通過灌胃的方式將IAID(65 μg/kg溶于10%的DMSO中)注入IAID組小鼠食道內(nèi)，模型組灌注同體積的10% DMSO溶液，對(duì)照組不做任何處理。

1.4 大體觀察及組織樣本處理 于實(shí)驗(yàn)第10天用千分尺測(cè)量小鼠耳厚，并拍照存檔；小鼠眼球采血，吸取上清存于-20℃用于ELISA檢測(cè)IgE水平；然后處死小鼠，剪下小鼠耳朵，小鼠耳部皮膚取0.2 cm寬1 cm長進(jìn)行福爾馬林固定，制作石蠟切片，用作HE和肥大細(xì)胞染色；其余耳部組織存于-80°，用于RNA的提取。

1.5 HE染色 標(biāo)本先用4%甲醛浸泡24 h，自動(dòng)脫水機(jī)脫水后進(jìn)行透明處理，浸蠟5 h后用石蠟包埋，4 μm 連續(xù)切片60℃烘烤30 min后進(jìn)行染色。

1.6 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞因子的表達(dá) 采用Trizol法提取總RNA，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。IL33上游引物5’-CTTCTCTGCCTATCCACGGG-3’；下游引物5’-CTCAGGGAGGCAGGAGACT-3’；HPRT上游引物5’-AATTATGGACAGGACTGAACGTCTTGCT-3’；下游引物5’-TCCAGCAGGTCAGCAAAGAATTTATAGC-3’；IL4上游引物5’-CCCCAGCTAGTTGTCATCCTG-3’；下游引物5’-CAAGTGATTTTTGTCGCATCCG-3’；IL5上游引物5’-GACCTTGACACAGCTGTCCG-3’；下游引物5’-ATTTCCACAGTACCCCCACG-3’；TSLP上游引物5’-CCCCGACAAAACATTTGCCC-3’；下游引物5’-TGCCATTTCCTGAGTACCGTC-3’；IL13上游引物5’-GCCAAGATCTGTGTCTCTCCC-3’；下游引物5’-CACTCCATACCATGCTGCCG-3’。

1.7 ELISA檢測(cè)血清總IgE 小鼠眼球采血，靜置2 h左右，離心1200 r/min，5 min后吸取上清嚴(yán)格按照試劑盒提供的步驟操作。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用Graphpad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。組間比較用Mann-Whitney T檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IAID可以減輕大體炎癥 造模10天后，與模型組小鼠相比，IAID組耳廓紅腫明顯減輕，鱗屑明顯減少(圖1a～c)。千分尺測(cè)得IAID組的耳厚(391.88±52.42 μm)比模型組(608±120.88 μm)明顯變薄(圖1g),HE染色也證實(shí)表皮和真皮厚度薄于模型組。另外，真皮中浸潤的炎細(xì)胞也有明顯減少(圖1d～f)。以上結(jié)果證明，IAID可以抑制炎細(xì)胞的浸潤，減輕炎癥引起的耳部紅腫。

2.2 IAID可以抑制Th2型細(xì)胞因子的分泌 由于AD是一個(gè)Th2型為主的免疫反應(yīng)，在MC903誘導(dǎo)的小鼠模型中，皮膚中的Th2細(xì)胞因子升高；另外，越來越多的觀點(diǎn)認(rèn)為，TSLP是啟動(dòng)AD發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵分子。因此，我們通過RT-PCR的方法檢測(cè)小鼠耳部組織中IL4、IL5、IL6、IL13、IL33、TSLP的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IAID組的IL4、IL5、IL6、IL33的水平與AD模型組沒有明顯差別(圖2a、b、c、e)，但I(xiàn)L13、TSLP的mRNA水平比MC903組明顯降低(圖2d、f),且以TSLP降低的程度更為明顯。綜合以上結(jié)果，我們認(rèn)為IAID可能主要是通過抑制TSLP的表達(dá)進(jìn)而抑制MC903誘導(dǎo)的炎癥。

2.3 IAID組總IgE水平降低 眾所周知，Th2型細(xì)胞可以通過其產(chǎn)生的炎癥因子，促進(jìn)B細(xì)胞的類別轉(zhuǎn)換，促進(jìn)IgE的產(chǎn)生。因而我們通過ELISA的方法，檢測(cè)了小鼠外周血中總IgE的水平。我們發(fā)現(xiàn)，與MC903組相比，IAID組外周血中的總IgE水平有明顯下降(P<0.001)(圖3)。該結(jié)果說明，IAID可以通過抑制IgE的產(chǎn)生，抑制炎癥的進(jìn)展。

3 討論

MC903模型是研究AD炎癥的一種很穩(wěn)定的模型，其關(guān)鍵環(huán)節(jié)是MC903促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌TSLP，TSLP與免疫細(xì)胞上的受體結(jié)合，激活免疫細(xì)胞，引起了大體的炎癥表現(xiàn)：皮膚紅腫、結(jié)痂、瘙癢，真皮中炎細(xì)胞浸潤增多，Th2型細(xì)胞因子水平升高，血中總IgE水平的升高等一系列系統(tǒng)癥狀[3]。本研究基于本模型探討了色氨酸代謝產(chǎn)物IAID在AD炎癥中的作用，結(jié)合以上數(shù)據(jù)并基于文獻(xiàn)分析，我們認(rèn)為IAID可能通過激活了腸道的免疫細(xì)胞，后者遷移到皮膚表面，與角質(zhì)形成細(xì)胞相互作用，抑制了TSLP的產(chǎn)生，其被抑制后刺激T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的能力減弱，因而導(dǎo)致Th2型細(xì)胞因子分泌減少，抑制AD的炎癥，但確切機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

腸道菌群的重要性被越來越多的人所認(rèn)識(shí)，其代謝產(chǎn)物被認(rèn)為是人體生理功能的重要調(diào)節(jié)分子[4]。研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群的代謝不僅與腸道疾病相關(guān)，與肥胖、腫瘤、衰老、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)系也非常密切[5-7]。在此背景下，腸道菌群與皮膚疾病的相關(guān)研究也逐漸引起人們的重視,研究發(fā)現(xiàn)嬰兒濕疹的患者腸道菌群的多樣性減少[8]，腸道菌群通過調(diào)節(jié)Th17型的免疫應(yīng)答，參與咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣皮炎的發(fā)生[9]，然而腸道菌群代謝在AD中發(fā)揮的作用尚無報(bào)導(dǎo)。

圖1 a～c:依次為對(duì)照組、模型紅、IAID組，c較d紅腫減輕，鱗屑明顯減少；d～f：依次為對(duì)照組、模型紅、IAID組真皮內(nèi)浸潤的炎細(xì)胞也明顯減少(HE,×200)；g:千分尺測(cè)量小鼠耳廓厚度，IAID組的耳厚比模型組薄(n=5,*P<0.05)；h、i：HE染色后鏡下測(cè)得，IAID組表皮以及真皮厚度比模型組薄(n=5,*P<0.05)

圖2 a～f，依次是IL4,IL5,IL6,IL13,IL33,TSLP的mRNA水平(n=5，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

圖3 小鼠血清總IgE水平(n=5,***P<0.001)

腸道菌群代謝所需氮源主要來源于色氨酸，后者是一種必需氨基酸，廣泛存在于高蛋白質(zhì)食物(蛋類、魚類、肉、奶酪等)之中，人體在攝入上述食物后，腸道菌群會(huì)將色氨酸分解而產(chǎn)生各種吲哚類代謝產(chǎn)物，例如吲哚-3-乙酸、吲哚-3-丙酸、吲哚-3-甲醛(IAID)等[10]。研究發(fā)現(xiàn)這些代謝產(chǎn)物在介導(dǎo)菌群與宿主的免疫應(yīng)答中發(fā)揮了重要作用[11]，在腦脊髓炎模型中色氨酸的代謝產(chǎn)物減少，通過外源添加色氨酸代謝產(chǎn)物IAID后，炎癥相關(guān)評(píng)分會(huì)降低[12]。另一研究發(fā)現(xiàn)腸道乳酸桿菌代謝色氨酸產(chǎn)生IAID，后者通過激活芳香烴受體參與黏膜免疫的調(diào)節(jié)。然而，IAID是否也參與對(duì)AD的調(diào)節(jié)尚不明確。

本研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群的代謝產(chǎn)物IAID可以緩解MC903誘導(dǎo)的AD樣炎癥，為揭示腸道菌群與AD的關(guān)系、研究調(diào)控AD的新策略進(jìn)行了積極的探索。

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(收稿：2016-08-30 修回：2016-09-26)

The impact of gut microbial metabolite on mouse model of atopic dermatitis

YUJinlei,ZHUZhenlai,ZHANGYueqiang,ZHANGChen,LIWei.

DepartmentofDermatology,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032,China

LIWei,E-mail:liweiderma@163.com

Objective: To determine the impact of gut microbial metabolite indole-3-carboxaldehyde (IAID) on mouse model of atopic dermatitis (AD). Methods: C57 mice were divided into 3 groups: control group, model group and IAID group. Vitamin D3 analog MC903 was applied on on mice ear to establish an AD-like model. The mice in IAID group were gavaged with 65 μg/kg IAID, and the same amount of DMSO as a vehicle control through administration by gavaging. At day 10, The mice ears were observed for any inflammatory sign and the thickness of the ears were measured. The RT-PCR technique was used to detect the expression of IL4, IL5, IL6, IL13, IL33, TSLP in whole skin and ELISA technique was used to detect the level of total IgE. Results: Compared to model group, we observed a obvious alleviation in IAID group with a decreased level of total IgE (P<0.001) and IL13, TSLP (P<0.05). Conclusion: Gut microbial metabolite IAID can relieve the severity of AD-like inflammation in the mice model.

atopic dermatitis; indole-3-carboxaldehyde (IAID ); gut microbial flora

第四軍醫(yī)大學(xué)西京皮膚醫(yī)院，陜西西安，710032

李巍，E-mail: liweiderma@163.com