林天興+龔明福+管芩瀾

摘要：生活在魔芋組織中的內(nèi)生細(xì)菌具有拮抗魔芋軟腐病病菌的潛力。通過(guò)組織分離法從魔芋塊莖中分離得到內(nèi)生細(xì)菌，用牛津杯法皿內(nèi)測(cè)試內(nèi)生細(xì)菌對(duì)魔芋軟腐病菌的拮抗作用，使用腸桿菌重復(fù)居間序列聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（enterobacterial repetitive intergenic consensus polymerase chain reaction，ERIC-PCR）方法研究其遺傳多樣性。結(jié)果表明，從魔芋塊莖中分離得到35株內(nèi)生細(xì)菌，35株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)魔芋軟腐病菌均有不同程度的拮抗活性，ERIC-PCR指紋圖譜顯示35株內(nèi)生細(xì)菌在Watson距離為0.60時(shí)可分為4個(gè)ERIC群和4株獨(dú)立成群菌株，表明35株拮抗性?xún)?nèi)生細(xì)菌的遺傳多樣性明顯。

關(guān)鍵詞：魔芋；內(nèi)生細(xì)菌；胡蘿卜軟腐歐文氏菌；多樣性

中圖分類(lèi)號(hào)： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2016）08-0197-02

魔芋（Amorphaphallus konjac）是天南星科魔芋屬單子葉多年生草本植物。魔芋塊莖中葡甘聚糖（KGM）含量非常豐富，已被應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工行業(yè)和農(nóng)業(yè)，因此魔芋在中國(guó)有廣泛的栽培。魔芋軟腐病是魔芋的主要病害，已經(jīng)嚴(yán)重影響到魔芋的生產(chǎn)，是魔芋產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要障礙。該病是由胡蘿卜軟腐歐文氏菌（Erwinia carotovora subsp. carotovora，簡(jiǎn)稱(chēng)Ecc）引起的細(xì)菌性病害[1]，除了魔芋，Ecc還可能導(dǎo)致花椰菜、番茄、辣椒、白菜、蘿卜、豆科植物及其他植物的軟腐病。

芽孢桿菌在自然界存在非常普遍，可以生產(chǎn)各種抗菌物質(zhì)，抑制植物病原菌[2]，有許多利用芽孢桿菌來(lái)生物防治魔芋軟腐病的例子[3-7]。筆者課題組近年來(lái)從四川省夾江縣、峨眉山和沐川縣魔芋塊莖中分離得到35株內(nèi)生細(xì)菌，對(duì)內(nèi)生細(xì)菌拮抗魔芋軟腐病菌的能力進(jìn)行了測(cè)定，使用總DNA序列腸桿菌重復(fù)居間序列聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（enterobacterial repetitive intergenic consensus polymerase chain reaction，ERIC-PCR）方法，研究了35株魔芋拮抗性?xún)?nèi)生細(xì)菌的遺傳多樣性，為魔芋軟腐病的生物防治提供菌株資源。

1材料與方法

1.1魔芋內(nèi)生細(xì)菌的分離

從四川省夾江縣、峨眉山、沐川縣的魔芋種植區(qū)中采集150個(gè)魔芋的球莖，每個(gè)球莖表面用0.1% HgCl2消毒，漂洗后用滅菌蒸餾水清洗5次。表面消毒的球莖用無(wú)菌粉碎機(jī)粉碎，取汁液劃線于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA，包括牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，瓊脂15.0 g/L）平板上，28 ℃ 恒溫培養(yǎng)3 d后對(duì)單個(gè)菌落進(jìn)一步純化，多次重復(fù)上述操作，得到的純菌落接種到試管斜面中保存?zhèn)溆?。最?次球莖表面消毒的水接種在NA培養(yǎng)基上，并在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 d來(lái)徹底檢查表面消毒是否徹底。

1.2抑制魔芋軟腐病菌的拮抗菌篩選

在NA板涂布接種0.1 mL軟腐病菌培養(yǎng)液（109～1010 CFU/mL）。取4個(gè)規(guī)格相同的滅菌牛津杯（內(nèi)徑6 mm、外徑8 mm）均勻插入NA板之間并保證牛津杯不能接觸到NA平板的底部。分裝100 μL測(cè)試供試內(nèi)生菌菌液于3個(gè)牛津杯中。最后1個(gè)牛津杯中裝入100 μL的滅菌的菌液作為對(duì)照組，每處理重復(fù)3次，28 ℃下培養(yǎng)48 h后測(cè)量抑菌圈的大小。內(nèi)生細(xì)菌對(duì)病原細(xì)菌的拮抗活性用菌落抑制大?。╟olony inhibited size，CIS）表示，CIS=供試菌株抑菌圈-牛津杯外徑。

1.3拮抗性?xún)?nèi)生細(xì)菌ERIC-PCR指紋圖譜分析

拮抗性?xún)?nèi)生細(xì)菌總基因組DNA提取參考徐琳等的方法[8]。特異性引物選擇ERIC1R和ERIC2L[9]，由上海香農(nóng)生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。反應(yīng)體系為25 μL，其成分是10×緩沖區(qū)（Biorule）2.5 μL，MgCl2（25 mmol/μL）2.0 μL、dNTP（2.5 mmol/L）2.0 μL，ERIC1R（20 pmol/μL）0.5 μL，ERIC2L（20 pmol/μL）0.5 μL，添加13 μL ddH2O，增加總DNA模板（40～80 ng）4.0 μL。ERIC-PCR反應(yīng)過(guò)程參考馬溪平等描述的方法[10]。反應(yīng)結(jié)束采用1%瓊脂糖凝膠電泳 3.5 h，凝膠成像，圖像掃描至計(jì)算機(jī)保存圖譜，在有條帶的位置記為“1”，沒(méi)有的記為“0”。采用DPS軟件，根據(jù)組平均連鎖聚類(lèi)法（UPGMA）樹(shù)形聚類(lèi)圖進(jìn)行0-1的聚類(lèi)分析[11]。

2結(jié)果與分析

2.1魔芋內(nèi)生細(xì)菌的分離

從健康魔芋球莖中分離得到35株內(nèi)生細(xì)菌，其中10株采自?shī)A江縣（菌株編號(hào)為AKEB01至AKEB10），15株采自峨眉山（菌株編號(hào)為 AKEB11至AKEB25）及10株采自沐川縣（菌株編號(hào)為AKEB25至AKEB35）。

2.2抑制魔芋軟腐病菌的拮抗菌篩選

從魔芋中分離得到的35株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)魔芋軟腐病菌均具有不同程度的拮抗活性（表1），不同菌株的拮抗活性有顯著差異，7株拮抗性?xún)?nèi)生細(xì)菌（AKEB06、AKEB16、AKEB20、AKEB23、AKEB28、AKEB32、AKEB35）的拮抗活性較強(qiáng)，平均抗菌距離超過(guò)15.0 mm，其中AKEB06拮抗活性最強(qiáng)，平均抗菌距離19.3 mm。

3結(jié)論

從健康魔芋球莖中分離得到35株內(nèi)生細(xì)菌菌株，這些內(nèi)生細(xì)菌對(duì)魔芋軟腐病菌均有不同程度的拮抗活性，其中7株抗菌距離超過(guò)15.00 mm。ERIC-PCR分析表明，當(dāng)Watson距離0.60時(shí)，35株拮抗性?xún)?nèi)生細(xì)菌菌株可分為4個(gè)ERIC群和4個(gè)獨(dú)立成群的菌株，當(dāng)Watson距離為1.00時(shí)所有測(cè)試菌株聚集在一起。研究結(jié)果表明拮抗性?xún)?nèi)生細(xì)菌存在遺傳多樣性。

目前，拮抗細(xì)菌性病原的物質(zhì)大多基于體外抗菌法從草藥及其提取物中篩選獲得，從魔芋中分離得到的內(nèi)生細(xì)菌菌株表現(xiàn)出較好的拮抗活性，并且多樣性明顯，因此，從魔芋內(nèi)生細(xì)菌中篩選具有軟腐病抗性的內(nèi)生細(xì)菌菌株資源非常豐富。

參考文獻(xiàn)：

[1]Toth I K，Bell K S，Holeva M C，et al. Soft rot erwiniae：from genes to genomes[J]. Molecular plant pathology，2003，4（1）：17-30.

[2]Tamehiro N，Okamoto-Hosoya Y，Okamoto S，et al. Bacilysocin，a novel phospholipid antibiotic produced by Bacillus subtilis 168[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2002，46（2）：315-320.