孫運(yùn)良，馬建霞，滿曉華，吳紅玉

(1.江蘇省連云港市贛榆區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科 222100；2.上海復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200338；3.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200433)

p38MAPK信號(hào)通路在TLR4促進(jìn)胰腺癌血管生成中的作用*

孫運(yùn)良1，馬建霞2△，滿曉華3，吳紅玉3

(1.江蘇省連云港市贛榆區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科 222100；2.上海復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200338；3.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200433)

目的 探討Toll樣受體-4(TLR4)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信號(hào)通路在胰腺癌血管生成中的作用。方法 以脂多糖(LPS)、TLR4-siRNA及p38MAPK信號(hào)通路阻斷劑SB203580分別作用于體外培養(yǎng)的胰腺癌PANC-1細(xì)胞，Westernblot檢測(cè)TLR4、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶(p-p38)蛋白表達(dá)。收集各種因素處理后的PANC-1細(xì)胞培養(yǎng)液，觀察其對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)增殖、遷移和管腔形成的影響。結(jié)果LPS組的HUVECs增殖率、遷移數(shù)目和管腔形成個(gè)數(shù)分別為(139.2±12.6)%、48.1±9.1和47.8±9.6，均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。TLR4-siRNA組的HUVECs增殖率、遷移數(shù)目和管腔形成個(gè)數(shù)分別為(60.2±8.7)%、31.3±4.5和17.2±3.3，均顯著低于對(duì)照組(P<0.01)；SB203580組的HUVECs增殖率[(79.6±8.9)%]、遷移數(shù)目(21.6±4.3)和管腔形成個(gè)數(shù)(23.5±4.3)均較對(duì)照組顯著減少(P<0.05)；且TLR4-siRNA+LPS、B203580+LPS組的HUVECs增殖率、遷移數(shù)目和管腔形成個(gè)數(shù)均分別顯著低于LPS組(P<0.01)。與對(duì)照組相比，LPS組VEGF、p-p38蛋白表達(dá)均明顯增加，TLR4-siRNA組、SB203580組TLR4、VEGF、p-p38蛋白表達(dá)明顯減少；且TLR4-siRNA+LPS組、SB203580+LPS組VEGF、p-p38表達(dá)較LPS組明顯減少。結(jié)論TLR4可促進(jìn)胰腺癌的血管生成，其機(jī)制與激活p38MAPK信號(hào)通路、促進(jìn)VEGF表達(dá)有關(guān)。

Toll樣受體4；胰腺腫瘤；血管生成；p38絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路；血管內(nèi)皮生長因子

Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是近年來發(fā)現(xiàn)的Ⅰ型跨膜蛋白質(zhì)。其中，TLR4是最早發(fā)現(xiàn)的，同時(shí)也是研究最為廣泛的TLRs家族成員，主要識(shí)別革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁成分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)。近年來研究表明，TLR4在腫瘤細(xì)胞呈高表達(dá)，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，但其促腫瘤的確切機(jī)制尚未完全闡明[1-3]。血管生成已被證實(shí)在腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[4-5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，TLR4在胰腺癌組織中呈高表達(dá)，且高表達(dá)的TLR4與胰腺癌的血管生成有關(guān)[2]，但TLR4促血管生成的機(jī)制有待于進(jìn)一步明確。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是目前已知的最重要的促血管生成因子，在諸多調(diào)控VEGF表達(dá)的信號(hào)通路中，p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信號(hào)通路已被證實(shí)具有重要的作用[6-7]。本研究以LPS、TLR4-siRNA及p38 MAPK信號(hào)通路阻斷劑SB203580分別作用于體外培養(yǎng)的胰腺癌PANC-1細(xì)胞，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液作用于人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)，觀察HUVECs增殖、遷移及管腔形成的變化，分析TLR4對(duì)p38 MAPK信號(hào)通路及VEGF表達(dá)影響，探討TLR4促胰腺癌血管生成的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1購自美國ATCC公司；HUVECs購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所；TLR4-siRNA(上游：5′-CUU UAU CCA ACC AGG UGC AUU UU-3′；下游：5′-AAU GCA CCU GGU UGG AUA AAG UU-3′)由上海吉瑪生物技術(shù)有限公司合成；LPS和SB203580均為Sigma公司產(chǎn)品；兔抗人TLR4、VEGF多克隆抗體購自Santa Cruz公司；鼠抗人磷酸化P38絲裂活化蛋白激酶(p-p38)的單克隆抗體和p38的多克隆抗體均購自Cell Signaling公司；Transwell小室購自Coster公司；Matrigel購自BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) PANC-1細(xì)胞和HUVECs在含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液中，37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)液中含青霉素、鏈霉素各100 U/mL。將PANC-1細(xì)胞以每孔1×106的量加入6孔板，待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行下列的分組實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組：不加任何處理因素；LPS組：加入1 μg/mL的LPS處理24 h；TLR4-siRNA組：加入100 pmol/mL的TLR4-siRNA處理4 h；TLR4-siRNA+LPS組：加入100 pmol/mL的TLR4-siRNA處理4 h后繼續(xù)加入1 μg/mL的LPS處理24 h；SB203580組：加入20 μmol/L的SB203580處理2 h；SB203580+LPS組：加入20 μmol/L的SB203580處理2 h后繼續(xù)加入1 μg/mL的LPS處理24 h。收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清液分別作用于體外培養(yǎng)的HUVECs。

1.2.2 TLR4-siRNA轉(zhuǎn)染 將PANC-1細(xì)胞以1×106/孔的量加入6孔板，待細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)液，進(jìn)行后續(xù)的TLR4-siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。具體轉(zhuǎn)染步驟如下：將100 pmol TLR4-siRNA加入到100 μL的無血清的DMEM培養(yǎng)基柔和混勻；用100 μL無血清的DMEM稀釋5 μL lipofectamin2000試劑，輕輕混勻，室溫放置5 min；將稀釋好的TLR4-siRNA和lipofectamin2000試劑混合，輕柔混勻，室溫放置20 min，以形成TLR4-siRNA/lipofectamin復(fù)合物；將6孔板的每孔中加入上述200 μL TLR4-siRNA/lipofectamin復(fù)合物和800 μL無血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去培養(yǎng)液，加入或不加入LPS繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.3 四甲基噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)HUVECs增殖 將HUVECs以5×103/孔的量加入96孔板，待細(xì)胞貼壁后，更換為各組PANC-1細(xì)胞培養(yǎng)液，37 ℃，5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀波長570 nm處測(cè)量各孔的吸光度值(A值)。細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗(yàn)孔A值/對(duì)照孔A值)×100%。

1.2.4 Transwell小室檢測(cè)HUVECs的遷移能力 常規(guī)培養(yǎng)HUVECs，收集細(xì)胞，用各組PANC-1細(xì)胞培養(yǎng)液上清液將HUVECs備成5×105/mL細(xì)胞懸液，取200 μL細(xì)胞懸液接種至Transwell上室，在下室加入700 μL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，取出Transwell小室，用棉簽將小室上層的細(xì)胞擦除，磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕沖洗，晾干，然后用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，去除多余結(jié)晶紫染液，普通光學(xué)顯微鏡下觀察。每個(gè)濾膜隨機(jī)選取5個(gè)400倍視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，以穿膜細(xì)胞的數(shù)目表示HUVECs的遷移能力。

1.2.5 Matrigel檢測(cè)HUVECs的管腔形成能力 常規(guī)培養(yǎng)HUVECs，收集細(xì)胞，用PANC-1細(xì)胞培養(yǎng)液上清重新懸浮，以1×105/孔的量接種于預(yù)鋪Matrigel的24孔板中。37 ℃，5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，倒置顯微鏡下觀察。選取3個(gè)視野計(jì)算所形成管腔個(gè)數(shù)的平均值。

1.2.6 Western blot檢測(cè)PANC-1細(xì)胞TLR4、p38、p-p38和VEGF蛋白表達(dá) 用RIPA裂解液制備細(xì)胞總蛋白，蛋白分析系統(tǒng)測(cè)定蛋白濃度，上樣于20%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜。室溫下用含5%脫脂奶粉的1×TBS封膜2 h。加入TLR4、p38、p-p38、VEGF抗體，4 ℃孵育過夜，洗膜后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影。結(jié)果用凝膠圖像軟件分析系統(tǒng)對(duì)膠片掃描，與內(nèi)參照β-actin進(jìn)行比較。

2 結(jié) 果

2.1TLR4對(duì)胰腺癌血管生成的影響LPS組的HUVECs增殖率、遷移數(shù)目和管腔形成個(gè)數(shù)分別為(139.2±12.6)%、48.1±9.1和47.8±9.6，均顯著高于對(duì)照組的(99.5±9.3)%、40.3±6.7和31.5±5.3(P<0.05)。而TLR4-siRNA組的HUVECs增殖率、遷移數(shù)目和管腔形成個(gè)數(shù)分別為(60.2±8.7)%、31.3±4.5和17.2±3.3，均顯著低于對(duì)照組(P<0.01)；而TLR4-siRNA+LPS組的HUVECs增殖率、遷移數(shù)目和管腔形成個(gè)數(shù)分別為(88.8±9.1)%、35.6±5.2和26.8±5.1，均顯著低于LPS組(P<0.01)，經(jīng)TLR4-siRNA預(yù)處理后，LPS促進(jìn)HUVECs增殖、遷移和管腔形成的能力明顯下降。

2.2p38MAPK信號(hào)通路在TLR4促胰腺癌血管生成中的作用 與對(duì)照組相比，SB203580組的HUVECs增殖率[(79.6±8.9)%]、遷移數(shù)目(21.6±4.3)和管腔形成個(gè)數(shù)(23.5±4.3)均顯著減少(P<0.05)；而SB203580+LPS組的HUVECs增殖率[(109.7±12.6)%]、遷移數(shù)目(31.8±5.7)和管腔形成個(gè)數(shù)(29.2±5.3)均顯著低于LPS組(P<0.05)，經(jīng)SB203580阻斷p38MAPK信號(hào)通路后，LPS促進(jìn)HUVECs增殖、遷移和管腔形成的能力明顯下降。

2.3TLR4對(duì)PANC-1細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，經(jīng)LPS作用后，盡管PANC-1細(xì)胞TLR4蛋白表達(dá)無明顯變化，但VEGF、p-p38蛋白表達(dá)均明顯增加，而TLR4-siRNA可明顯抑制PANC-1細(xì)胞TLR4、VEGF、p-p38蛋白表達(dá)；且TLR4-siRNA可顯著抑制LPS對(duì)VEGF、p-p38表達(dá)的誘導(dǎo)作用，見圖1。

1：對(duì)照組；2：LPS組；3：TLR4-siRNA組；4：TLR4-siRNA+LPS組。

圖1LPS、TLR4-siRNA對(duì)PANC-1細(xì)胞TLR4、VEGF、p38、p-p38蛋白表達(dá)的影響

2.4p38MAPK信號(hào)通路在TLR4促進(jìn)PANC-1細(xì)胞表達(dá)VEGF中的作用 為了進(jìn)一步驗(yàn)證TLR4蛋白可通過激活p38MAPK通路促進(jìn)VEGF表達(dá)，本研究分別以LPS和SB203580作用于PANC-1細(xì)胞。Westernblot的結(jié)果顯示，經(jīng)SB203580阻斷p38MAPK通路后，PANC-1細(xì)胞VEGF、p-p38蛋白表達(dá)均較對(duì)照組明顯下降，且阻斷p38MAPK通路可明顯逆轉(zhuǎn)LPS所誘導(dǎo)的VEGF、p-p38表達(dá)，見圖2。

1：對(duì)照組；2：LPS組；3：SB203580組；4：SB203580+LPS組。

圖2LPS、SB203580對(duì)PANC-1細(xì)胞VEGF、p38、p-p38蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

TLR4主要表達(dá)于與宿主防御功能有關(guān)的免疫細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，這樣可以使TLR4更為方便地識(shí)別胞外細(xì)菌及其配體，誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列的炎性介質(zhì)從而產(chǎn)生強(qiáng)有力的炎癥反應(yīng)[8]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，TLR4還在多種腫瘤細(xì)胞呈高表達(dá)，具有抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、黏附、轉(zhuǎn)移，以及免疫逃逸的作用[1-3,9]。已有的研究證實(shí)，TLR4在胰腺癌組織中高表達(dá)，且高表達(dá)的TLR4與胰腺癌的血管生成密切相關(guān)，提示TLR4在胰腺癌的發(fā)生與發(fā)展中起著重要的作用[2,10]。胰腺癌的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移必須依賴腫瘤血管生成，抗血管生成已成為胰腺癌治療研究的一個(gè)重要領(lǐng)域[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LPS作用后的PANC-1細(xì)胞培養(yǎng)液可顯著促進(jìn)HUVECs細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，而經(jīng)TLR4-siRNA作用后的PANC-1細(xì)胞培養(yǎng)液可明顯抑制HUVECs細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，表明TLR4具有促進(jìn)血管生成的作用。VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的最為重要的促血管生成因子之一，在腫瘤的發(fā)展過程中起著重要的作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LPS作用后，PANC-1細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)明顯增加，而TLR4-siRNA可明顯抑制VEGF蛋白表達(dá)，表明TLR4具有誘導(dǎo)VEGF表達(dá)的作用。Riddell等[13]通過對(duì)前列腺癌的研究也發(fā)現(xiàn)，TLR4具有調(diào)控VEGF表達(dá)的能力，可促進(jìn)腫瘤血管的生成，然而TLR4促進(jìn)VEGF表達(dá)的機(jī)制尚有待于進(jìn)一步明確。

p38MAPK是絲裂原活化蛋白激酶家族成員之一，廣泛存在于細(xì)胞中，是參與細(xì)胞生長、增殖、分化調(diào)節(jié)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。目前已證實(shí)，p38MAPK通路在多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)呈持續(xù)激活狀態(tài)，持續(xù)激活的p38MAPK通路可誘導(dǎo)VEGF及IL-8等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而在促進(jìn)腫瘤血管生成過程發(fā)揮重要的作用[6-7]。本研究也發(fā)現(xiàn)，阻斷p38MAPK通路后，PANC-1細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)顯著下降，且培養(yǎng)液對(duì)HUVECs的增殖、遷移及管腔形成均有明顯的抑制作用，同樣證實(shí)p38MAPK通路可通過誘導(dǎo)VEGF表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管生成。研究表明，TLR4可促進(jìn)p38蛋白的磷酸化，激活p38MAPK通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長；而使用RNA干擾技術(shù)沉默TLR4基因后，可抑制p38MAPK通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS可促進(jìn)PANC-1細(xì)胞p-p38的表達(dá)，而TLR4-siRNA在抑制TLR4表達(dá)的同時(shí)可抑制p-p38的表達(dá)，表明TLR4具有激活胰腺癌細(xì)胞p38MAPK通路的作用。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，阻斷p38MAPK通路可明顯阻斷LPS對(duì)PANC-1細(xì)胞VEGF表達(dá)的誘導(dǎo)作用，并顯著抑制LPS作用后PANC-1細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)HUVECs增殖、遷移和管腔形成的促進(jìn)能力。這些結(jié)果表明，激活p38MAPK通路是TLR4誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)，從而促進(jìn)胰腺癌的血管生成的重要機(jī)制。

胰腺癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤，闡明其發(fā)病機(jī)制并尋找有效的治療靶點(diǎn)是目前迫切需要解決的重要課題。本研究表明，TLR4具有促進(jìn)胰腺癌血管生成的作用，其機(jī)制與激活p38MAPK信號(hào)通路，誘導(dǎo)VEGF表達(dá)有關(guān)。但胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展涉及多方面的復(fù)雜因素，TLR4的異常表達(dá)及其促血管生成可能只是其中的一種形式，其確切的分子機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

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Role of p38 MAPK signal pathway in TLR4 promoted angiogenesis of pancreatic cancer*

SunYunliang1,MaJianxia2△,ManXiaohua3,WuHongyu3

(1.DepartmentofGastroenterology,GanyuDistrictPeople′sHospital,Lianyungang,Jiangsu222100,China;2.DepartmentofGastroenterology,AffiliatedHuadongHospital,FudanUniversity,Shanghai200338,China;3.DepartmentofGastroenterology,AffiliatedChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China)

Objective To investigate the role of Toll like receptor-4 (TLR4) and p38 mitogen-activated protein kinase (p38 MAPK) signaling pathway in the angiogenesis of pancreatic neoplasms.Methods The in vitro cultured pancreatic cancer PANC-1 cells were treated with lipopolysaccharide (LPS),TLR4-siRNA and p38 MAPK signal pathway inhibitor SB203580.TLR4,vascular endothelial growth factor (VEGF)， p-p38 protein expression of PANC-1 cells were detected by Western blot.The culture supernatants of PANC-1 cells after various factors treatment were collected for observing their effects on the proliferation,migration and tube formation of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).Results The proliferation rate,number of migration and tube formation of HUVECs in the LPS group were (139.2±12.6)%,48.1±9.1 and 47.8±9.6,respectively,which were significantly higher than those in the control group (P<0.05).The proliferation rate,number of migration and tube formation of HUVECs in the TLR4-siRNA group were (60.2±8.7)%,31.3±4.5 and 17.2±3.3,respectively,which were significantly lower than those in the control group (P<0.01).The proliferation rate [(79.6±8.9)],number of migration(21.6±4.3) and tube formation (23.5±4.3) of HUVECs in the SB203580 group were significantly lower than those in control group(P<0.05),moreover the proliferation rate,number of migration and tube formation of HUVECs in the TLR4-siRNA+LPS and SB203580+LPS groups were significantly lower than those in the LPS group(P<0.01).Compared with the control group,VEGF and p-p38 protein expression in the LPS group were significantly increased,and TLR4,VEGF and p-p38 protein expression in the TLR4-siRNA and SB203580 groups were decreased;moreover VEGF and p-p38 protein expression in the TLR4-siRNA+LPS and SB203580+LPS groups were significantly decreased compared with the LPS group.Conclusion TLR4 may promote the angiogenesis in pancreatic cancer,its mechanism is related with activating the p38 MAPK signaling pathway and promoting VEGF expression.

Toll-like receptor 4；pancreatic neoplasms；angiogenesis；p38 mitogen-activated protein kinases signaling pathway；vascular endothelial growth factor

??·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.02.005

連云港市衛(wèi)生局科研項(xiàng)目(1427)；江蘇省衛(wèi)生廳科研項(xiàng)目(Y201420)。

孫運(yùn)良(1975-)，副主任醫(yī)師，博士，主要從事胰腺癌的發(fā)病機(jī)制與生物治療方面研究?！?/p>

Email：yz_mjx@163.com。

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1671-8348(2017)02-0161-04

2016-06-28

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