王雙雙 ， 吳勝奎 ， 孫江洋 ， 石金鳳 ， 宗 穎 ， 時 坤 ， 李健明 ， 趙 丹 ， 曾范利 ， 杜 銳，4

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院 ， 吉林 長春 130118 ； 2.吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院 ， 吉林 長春 130118 ；3.吉林農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究中心 ， 吉林 長春 130118 ；4.吉林省梅花鹿生產(chǎn)與產(chǎn)品應用研究室 ， 吉林 長春 130118)

金黃色葡萄球菌屬于革蘭陽性菌，廣泛存在于自然界，無論對人類健康還是食品安全等都具有危害。金黃色葡萄球菌還是醫(yī)院感染和社區(qū)獲得性感染的重要病原菌，可以引起各種感染。金黃色葡萄球菌為侵襲性細菌，能產(chǎn)生毒素，對腸道破壞性大，所以金黃色葡萄球菌腸炎起病急，中毒癥狀嚴重，主要表現(xiàn)為嘔吐、發(fā)熱、腹瀉。嘔吐常在發(fā)熱前出現(xiàn)，發(fā)熱很高。輕癥大便次數(shù)稍多，為黃綠色糊狀便；重癥大便次數(shù)頻繁，每日可達數(shù)十次，大便呈暗綠色水樣便，外觀像海水，所以叫海水樣便，黏液多，有腥臭味，體液損失多，患兒脫水、電解質(zhì)紊亂和酸中毒嚴重，可發(fā)生休克。金黃色葡萄球菌還是化膿性疾病的重要病菌，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染[1]。由于大量抗生素的使用使金黃色葡萄球菌產(chǎn)生耐藥，因此，研究探索其他抗金黃色葡萄球菌的有效藥物已勢在必行。而中藥在抗金黃色葡萄球菌方面具有獨特的優(yōu)勢，中醫(yī)是我國的傳統(tǒng)醫(yī)療方法，中藥物產(chǎn)豐富，而且成本較低。為了更好地了解中藥對金黃色葡萄球菌的抑菌情況，本研究采用常見的黃芩、黃連、黃柏、五倍子和魚腥草5種中藥提取物，對金黃色葡萄球菌進行抑制試驗和聯(lián)合抑菌試驗，為開發(fā)抗金黃色葡萄球菌藥物提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種 金黃色葡萄球菌本實驗室保存。

1.2 培養(yǎng)基 液體LB培養(yǎng)基、固體LB培養(yǎng)基、MH肉湯培養(yǎng)基、BP培養(yǎng)基(BP medium)和血平板(Blood plate)。

1.3 儀器 HHS型電熱恒溫水浴鍋(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠出品)；凈化工作臺(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；組合式搖床HYL-C2(太倉市強樂實驗設備有限公司)；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)；智能型生化培養(yǎng)箱SPX-300BSH-II(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；0.5麥氏比濁管(深圳康泰生物制品股份有限公司)。

1.4 中藥材 黃連，黃芩，黃柏，魚腥草，五倍子，均購自于長春長白山百草大藥房。

1.5 方法

1.5.1 中藥提取物的制備 按參考文獻[2-6]的方法，采用超聲波處理、乙醇回流、水浴加熱方法制備5味中藥的提取物，最后將提取物濃縮得到的提取物浸膏，編號后置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 復蘇菌種 將保存在-80 ℃冰箱中的菌種室溫融化，在凈化工作臺中用接種環(huán)蘸取菌液接種在固體LB培養(yǎng)基，放置37 ℃智能型生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察菌的生長情況。

1.5.3 金黃色葡萄球菌的鑒定 將生長良好，顏色為淡黃色凸起，邊緣圓滑的單個菌落接種于BP培養(yǎng)基和血平板上，放置生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h觀察菌的生長狀態(tài)。

1.5.4 菌液的制備 挑取固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長的金黃色葡萄球菌單個菌落于液體LB培養(yǎng)基中，放置組合式搖床搖12 h，待菌生長良好后取適量菌液以0.5麥氏比濁管為標準配制菌液，菌液濃度為107～108CFU/mL菌落。

1.5.5 藥物濃度的配制 取5支試管，分別稱取黃芩、黃連、黃柏、魚腥草和五倍子各4 g分別置于5支試管中，各加入8 mL的蒸餾水溶解配成濃度為500 mg/mL的藥液(進行標記)。取5組，每組各10支5mL的離心管，每組1～10進行編號，在2～10支試管中各加入1 mL高壓滅菌的蒸餾水，第1支試管加入用0.22 μm濾膜過濾的藥液2 mL。采用二倍試管稀釋法從第1支試管中吸取1 mL菌液加入第2支試管，混合均勻后吸取1 mL加入第3支試管，依次稀釋至第9支試管，則1～9試管中藥物的濃度依次為500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91 mg/mL和1.95 mg/mL，第10支試管作為空白對照試驗。

1.5.6 中藥提取物對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測定 將各組1～10(5 mL)支試管各加入1 mL的液體LB培養(yǎng)基，加入配制的菌液100 μL。放置智能型生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察各管中菌的生長情況，與第10管做對照。肉眼觀察不到菌生長的試管濃度為最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)。將各管完全抑制的液體在固體LB培養(yǎng)基上涂板，肉眼看不見菌落生長的最低濃度為最小殺菌質(zhì)量濃度(MBC)。參考劉忠義等[7]介紹的判斷標準：MIC<7.80 mg/mL，為高度敏感；7.80 mg/mL≤MIC≤250 mg/mL，為中度敏感；MIC>250 mg/mL，為不敏感。

1.5.7 聯(lián)合用藥 采用肉湯稀釋棋盤法[8]以黃芩、黃連、黃柏、魚腥草和五倍子各藥最小質(zhì)量濃度的2倍、1倍、1/2、1/4、1/8進行兩兩聯(lián)合藥敏試驗。試驗結(jié)果以聯(lián)合抑菌指數(shù)(FICI)作為聯(lián)合藥敏試驗的判斷依據(jù):FICI≤0.5為協(xié)同作用；0.52為拮抗作用。

2 結(jié)果

2.1 金黃色葡萄球菌的鑒定結(jié)果 BP培養(yǎng)基菌落的生長狀態(tài)為灰黑色菌落，周圍有透明帶。血平板上為黃色菌落，周圍有溶血環(huán)，通過鑒別培養(yǎng)證明此菌為金黃色葡萄球菌(見中插彩版圖1、圖2)。

圖1 血平板上金黃色葡萄球菌

圖2 BP培養(yǎng)基上的金黃色葡萄球菌

2.2 五味中藥對金黃色葡萄球菌的抑制情況 黃芩、黃連、黃柏、五倍子和魚腥草對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(MIC)分別為15.63 mg/mL、3.91 mg/mL、31.25 mg/mL、7.81 mg/mL和31.25 mg/mL；黃芩、黃連、黃柏、五倍子和魚腥草對金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度(MBC)分別為15.63 mg/mL、7.81 mg/mL、62.5 mg/mL、7.81 mg/mL和62.5 mg/mL。通過試驗可知不同的藥物對金黃色葡萄球菌的抑制情況不同，五倍子和黃連對金黃色葡萄球菌有顯著的抑菌效果，黃芩也有明顯的抑菌效果，黃柏和魚腥草對金黃色葡球菌的抑菌效果較弱(見表1)。

表15種中藥提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌作用

黃芩黃連黃柏五倍子魚腥草MIC(mg/mL)15.633.9131.257.8131.25MBC(mg/mL)15.637.8162.57.8162.5

2.3 五味中藥的聯(lián)合用藥情況 五倍子與黃芩、五倍子與黃連聯(lián)合用藥表現(xiàn)為協(xié)同作用；黃連與魚腥草、黃連與黃芩、五倍子與魚腥草的聯(lián)合抑菌指數(shù)均在0.5～1.0之間，表現(xiàn)為相加作用；黃連與黃柏、黃芩與黃柏、五倍子與黃柏、黃芩與魚腥草的聯(lián)合抑菌指數(shù)均在1～2之間，表現(xiàn)為無關(guān)作用；魚腥草與黃柏的聯(lián)合抑菌指數(shù)>2，表現(xiàn)為拮抗作用(見表2)。

表2五味中藥提取物對金黃色葡萄球菌的聯(lián)合抑菌作用

聯(lián)合用藥濃度FICI聯(lián)合用藥濃度FICIA-BA0.980.5B-DB1.950.75B1.95D15.63A-CA1.950.75B-EB7.811.5C3.91E15.63A-DA1.951C-DC7.811.5D15.63D62.5A-EA3.911.5C-EC15.631.5E15.63E15.63B-CB1.950.375D-ED62.5>2C1.95E62.5

A:黃連；B:五倍子；C:黃芩；D:魚腥草；E:黃柏FICI≤0.5為協(xié)同作用；0.52為拮抗作用

3 討論

不同中藥提取物的抑菌活性不同，大多數(shù)中藥的有效提取物對細菌、病毒等都有一定的作用。通過上述試驗可知，經(jīng)過水提得到的中藥提取物，不同的中藥對金黃色葡萄球菌的抑制作用不同。在這5種中藥中，黃連和五倍子對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強，黃芩的抑制作用一般，黃柏和魚腥草的抑制作用不明顯。藥物的聯(lián)合作用時，主要表現(xiàn)為協(xié)同作用、相加作用、無關(guān)作用和拮抗作用。經(jīng)試驗研究可知，對于5種中藥的聯(lián)合作用，黃連、黃芩與五倍子聯(lián)合用藥表現(xiàn)為協(xié)同作用，五倍子和黃芩的MIC值都降低為1.95 mg/mL，黃連MIC值降為0.98 mg/mL。黃連與魚腥草、黃芩，五倍子與魚腥草的聯(lián)合抑菌指數(shù)均在0.5～1.0之間，表現(xiàn)為相加作用。據(jù)文獻報道，黃連與黃芩配伍后，共煎液中會產(chǎn)生沉淀，黃連有效成分的含量比黃連單煎液中的含量有所降低，同時共煎液中黃芩中有效成分的含量也降低，且隨著黃芩比例的增加，降低的幅度加大。在新藥研制中，應采用分煎的方法，盡量避免有效成分的損失，從而提高療效[9]。本研究中黃連、黃芩分開煎煮，保留了有效成分，則黃連與黃芩的聯(lián)合抑菌效果良好。黃連的MIC值降低到了1.95 mg/mL，黃芩的MIC值降低到了3.91 mg/mL。黃連、黃芩、五倍子與黃柏，黃芩與魚腥草的聯(lián)合抑菌指數(shù)均在1～2之間，表現(xiàn)為無關(guān)作用。雖然表現(xiàn)為無關(guān)作用，但是黃柏和黃芩的MIC值均有所降低，說明黃連、黃連、五倍子中的提取物增強了黃柏的有效成分，魚腥草提取物增強了黃芩的有效成分。魚腥草與黃柏聯(lián)合抑菌指數(shù)>2為拮抗作用，可能是黃柏提取物的有效物質(zhì)抑制了魚腥草的有效成分，所以表現(xiàn)為拮抗作用。這為進一步開發(fā)抗金黃色葡萄球菌中藥奠定了理論基礎(chǔ)。

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