王楠楠 ， 梁 曉 ， 濮思源 ， 張啟迪

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 山東 青島 266109)

奶牛乳房炎是乳腺受到物理、化學(xué)、微生物等病原因子的刺激所致的一種炎癥反應(yīng)。我國(guó)奶牛乳房炎的發(fā)病率一般在20%～75%，其中臨床型乳房炎發(fā)病率在9.7%～55.6%，隱性乳房炎發(fā)病率卻高達(dá)20%～40%[1]。乳房炎導(dǎo)致產(chǎn)奶量和奶質(zhì)量下降，直接給我國(guó)的奶牛業(yè)、乳制品企業(yè)和社會(huì)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。流行病學(xué)研究表明，乳房炎在生殖性能上也有負(fù)面影響，臨床型乳房炎間接損害奶牛的生殖性能，使奶?？諔烟鞌?shù)增加、受胎率下降、早期流產(chǎn)比例增加、不規(guī)律的間隔發(fā)情[2]，由此造成的間接經(jīng)濟(jì)損失更是難以估量。當(dāng)乳汁受到隱性乳房炎致病因子侵害后，乳腺分泌細(xì)胞受到破壞，并且乳汁中含有大量的病原微生物及其產(chǎn)生的毒素，人類(lèi)食用后可引起發(fā)燒、嘔吐、腹瀉、脫水和過(guò)敏等癥狀。

近幾年，在政府優(yōu)惠政策的支持下，奶牛養(yǎng)殖業(yè)逐漸邁入產(chǎn)業(yè)化發(fā)展渠道，生產(chǎn)規(guī)模不斷擴(kuò)大。臨床型乳房炎得到了很好的控制，而隱性乳房炎對(duì)人類(lèi)經(jīng)濟(jì)和健康卻帶來(lái)了挑戰(zhàn)。本研究對(duì)濰坊某牛場(chǎng)隱性乳房炎進(jìn)行系統(tǒng)調(diào)查，并對(duì)病原菌進(jìn)行分離鑒定和藥物敏感性試驗(yàn)，探明乳房炎對(duì)藥物的耐藥狀況，采用敏感藥物治療，并提出相應(yīng)防治措施，對(duì)控制奶牛隱性乳房炎提供了相應(yīng)的技術(shù)支持和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試劑與培養(yǎng)基 美藍(lán)染液，購(gòu)自上海紀(jì)寧試劑有限公司；AccuMast乳房炎病原菌快速診斷皿，購(gòu)自美國(guó)FERA Animal Health動(dòng)保公司；藥敏紙片，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；MH培養(yǎng)基和MH肉湯，購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；胎牛血清，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 濰坊市某奶牛場(chǎng)，規(guī)模4 200頭奶牛，其中正在泌乳期的奶牛2 000頭，后備牛(青年牛、育成牛、犢牛)為2 200頭。

1.3 儀器設(shè)備 生物潔凈工作臺(tái)：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、光學(xué)顯微鏡：上海躍進(jìn)醫(yī)療機(jī)械廠。

1.4 采樣及細(xì)菌培養(yǎng) 采樣前應(yīng)對(duì)雙手進(jìn)行消毒，佩戴手套，用酒精棉徹底清潔乳頭末端和乳頭孔處，直至棉球表面沒(méi)有臟物為止，收集時(shí)需先棄掉頭幾把奶(3～5把)；采樣時(shí)保持采樣瓶45°傾斜，乳頭不要接觸瓶口。若一頭奶牛需要多個(gè)乳區(qū)采樣，消毒按照由里往外的順序消毒，而采樣則按照由前往后的順序；奶樣量應(yīng)為采樣瓶的二分之一到三分之二之間。采用顯微鏡直接體細(xì)胞計(jì)數(shù)法(DMSCC)，如每毫升乳汁體細(xì)胞數(shù)超過(guò) 50 萬(wàn)即可認(rèn)為是隱性乳房炎[3]，但是有關(guān)的規(guī)定和標(biāo)準(zhǔn)卻不盡相同，一般在20萬(wàn)～50萬(wàn)以?xún)?nèi)為安全。將體細(xì)胞數(shù)超過(guò)50萬(wàn)的奶樣進(jìn)行涂AccuMast乳房炎病原菌快速診斷皿，分別用3個(gè)無(wú)菌棉簽對(duì)一份奶樣在診斷皿的3個(gè)區(qū)域涂抹。將診斷皿置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)18 h，觀察記錄結(jié)果。

1.5 AccuMast乳房炎病原菌快速診斷皿診斷標(biāo)準(zhǔn) 一區(qū)革蘭陰性菌：藍(lán)色為克雷伯菌，粉色為大腸桿菌，白色菌群但介質(zhì)變黃為假單胞菌屬。二區(qū)革蘭陽(yáng)性鏈球菌屬：深藍(lán)色為乳房鏈球菌，淺藍(lán)色為鏈球菌屬，紫色為腸球菌屬，薰衣草色為乳酸乳球菌屬。三區(qū)革蘭陽(yáng)性葡萄球菌數(shù)：白色為葡萄球菌數(shù)，粉色為金黃色葡萄球菌，藍(lán)色為溶血葡萄球菌。

1.6 藥敏試驗(yàn) 按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(CLSI)2012年推薦的抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[5]。將鏈球菌屬和克雷伯菌挑取單菌落接種到MH肉湯培養(yǎng)基(鏈球菌要加入5%血清)，取200 μL菌液用涂布器在MH培養(yǎng)基(鏈球菌要加入5%血清)上涂勻，用鑷子放置藥敏紙片并輕壓，放置10 min。于37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)16 h，記錄結(jié)果。

1.7 治療 選擇對(duì)菌株敏感的藥物進(jìn)行乳頭注射治療。對(duì)鏈球菌屬引起的隱性乳房炎乳頭注射頭孢氨芐和卡那霉素，對(duì)克雷伯菌引起的隱性乳房炎乳頭注射頭孢噻呋，凝固酶陰性葡萄球菌感染的乳房炎先對(duì)其進(jìn)行排空乳區(qū)法，進(jìn)而乳頭注射孢氨芐和卡那霉素。其他細(xì)菌引起的隱性乳房炎均采用乳頭注射頭孢氨芐和卡那霉素。在對(duì)大腸桿菌感染的乳房炎進(jìn)行排空乳區(qū)法，使其自愈。一個(gè)療程為 4 d，每個(gè)療程統(tǒng)計(jì)治愈率，其中在前一個(gè)療程中治愈的，下一個(gè)療程不繼續(xù)給藥，4個(gè)療程無(wú)法治愈的定為瞎乳區(qū)(乳區(qū)完全沒(méi)奶或豆腐渣樣奶或清水奶)。

1.8 奶牛隱性乳房炎治療后檢測(cè)方法 治療結(jié)束后，進(jìn)行CMT試驗(yàn)，檢測(cè)藥物的治愈率。擠奶前用溫水清洗治療后的乳區(qū)，棄掉2把乳汁，然后每個(gè)乳區(qū)取2 mL奶樣置于CMT診斷盤(pán)中待檢測(cè)，每2 mL乳汁中加入2 mL的CMT診斷液，充分混合，根據(jù)凝集反應(yīng)判斷治愈情況。

1.9 奶牛隱性乳房炎治愈標(biāo)準(zhǔn)[5]。

表1CMT試驗(yàn)的判定標(biāo)準(zhǔn)

判定指標(biāo)乳汁凝集反應(yīng)體細(xì)胞總數(shù)(萬(wàn)/mL)陰性無(wú)變化0～20弱陽(yáng)性部分形成凝膠狀40～150陽(yáng)性全部呈凝膠狀,回旋搖動(dòng)時(shí)凝塊集中在中央,停止搖動(dòng)時(shí)呈凸凹狀附于底部。80～500強(qiáng)陽(yáng)性全部呈凝膠狀并保持原狀,并固著于底部。>500

2 結(jié)果

奶牛場(chǎng)中泌乳奶牛為2 000頭，通過(guò)顯微鏡體細(xì)胞直接計(jì)數(shù)法對(duì)2 000頭奶牛的每個(gè)乳區(qū)進(jìn)行體細(xì)胞計(jì)數(shù)，其中121頭奶牛中的253個(gè)乳區(qū)的體細(xì)胞超過(guò)50萬(wàn)。奶牛隱性乳房炎發(fā)病數(shù)為121頭， 發(fā)病率6.33%，發(fā)病乳區(qū)數(shù)為253。奶牛隱性乳房炎的發(fā)生率結(jié)果如表2所示。

表2奶牛隱性乳房炎的發(fā)生率

檢測(cè)奶牛/頭發(fā)病數(shù)/頭陽(yáng)性率/%發(fā)病乳區(qū)20001216.33253

在253例奶樣中鏈球菌屬檢出率最高為 46.24%，大腸桿菌為32.41%，克雷伯菌為16.60%，金黃色葡萄球菌僅有1例，AccuMast乳房炎病原菌快速診斷皿結(jié)果具體見(jiàn)表3。

主要病原菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。對(duì)濰坊某奶牛場(chǎng)中造成奶牛隱性乳房炎的主要細(xì)菌鏈球菌屬、克雷伯菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果中顯示鏈球菌屬對(duì)頭孢氨芐、頭孢噻呋、卡那霉素敏感，敏感率分別為82.05%、70.08%、67.52%，對(duì)氨芐青霉素耐藥，耐藥率為84.62%；克雷伯菌對(duì)頭孢噻呋敏感，敏感率為73.81%，對(duì)氨芐青霉素、紅霉素耐藥，耐藥率分別為71.43%、61.90%。

表3AccuMast乳房炎病原菌快速診斷皿結(jié)果

病菌菌株數(shù)菌株比例/%鏈球菌屬11746.24大腸桿菌8232.41克雷伯菌4216.60凝固酶陰性葡萄球菌41.58假單胞菌屬20.79腸球菌屬20.79乳酸乳球菌屬20.79金黃色葡萄球菌10.40其他菌屬10.40

對(duì)奶牛隱性乳房炎治療結(jié)果如表5所示：對(duì)鏈球菌屬治療1個(gè)療程時(shí)治愈率為77.78%，2個(gè)療程時(shí)治愈率為88.89%，3個(gè)療程時(shí)治愈率為90.60%，4個(gè)療程時(shí)治愈率為91.45%；對(duì)克雷伯菌治療1個(gè)療程時(shí)治愈率為30.95%，2個(gè)療程時(shí)治愈率為38.10%，3個(gè)療程時(shí)治愈率為40.48%，4個(gè)療程時(shí)治愈率為40.48%；對(duì)凝固酶陰性葡萄球菌治療1個(gè)療程時(shí)治愈率為25%，2個(gè)療程時(shí)治愈率為50%，3個(gè)療程時(shí)治愈率為50%，4個(gè)療程時(shí)治愈率為75%；對(duì)其他菌屬治療1個(gè)療程時(shí)治愈率為57.14%，2個(gè)療程時(shí)治愈率為85.71%，3個(gè)療程時(shí)治愈率為85.71%，4個(gè)療程時(shí)治愈率為85.71%。

表4主要病原菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表5藥物治療結(jié)果

病菌乳區(qū)數(shù)治療時(shí)間治愈率/%治療時(shí)間治愈率/%治療時(shí)間治愈率/%治療時(shí)間治愈率/%鏈球菌屬1174d77.78(91/117)8d88.89(104/117)12d90.60(106/117)16d91.45(107/117)克雷伯菌424d30.95(13/42)8d38.10(16/42)12d40.48(17/42)16d40.48(17/42)凝固酶陰性葡萄球菌44d25(1/4)8d50(2/4)12d50(2/4)16d75(3/4)其他菌屬74d57.14(4/7)8d85.71(6/7)12d85.71(6/7)16d85.71(6/7)

3 討論

造成濰坊某奶牛場(chǎng)奶牛乳房炎的主要病原菌為鏈球菌屬、 克雷伯菌和大腸桿菌。濰坊某奶牛場(chǎng)中金黃色葡萄球菌感染的奶牛隱性乳房炎僅有一例，在濰坊地區(qū)其他奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)中由金黃色葡萄球菌感染的奶牛隱性乳房炎卻高達(dá)10%。大腸桿菌性奶牛乳房炎多見(jiàn)于高產(chǎn)奶牛及產(chǎn)后泌乳高峰時(shí)期的奶牛，大腸桿菌主要來(lái)源于牛糞及其污染的環(huán)境，從損傷的生殖道進(jìn)入血液或淋巴而引起感染。對(duì)于大腸桿菌沒(méi)有采用抗生素治療的原因是，大腸桿菌死亡，細(xì)胞壁破裂會(huì)釋放內(nèi)毒素，細(xì)胞內(nèi)毒素在體內(nèi)，會(huì)誘發(fā)其他一系列病理反應(yīng)。有研究者認(rèn)為抗生素誘導(dǎo)釋放的內(nèi)毒素不僅是因?yàn)榭股貧绱竽c桿菌后，大腸桿菌壁破裂而釋放出來(lái)的，可能是細(xì)菌在抗生素作用下通過(guò)某些機(jī)制逐漸釋放出來(lái)[6]。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，鏈球菌屬對(duì)頭孢噻呋、頭孢氨芐、卡那霉素敏感，克雷伯菌對(duì)頭孢噻呋敏感。由于奶牛場(chǎng)中抗生素的濫用，使得一些病原菌產(chǎn)生耐藥性，因而單一藥物的治療很難取得理想效果，在治療過(guò)程中采用聯(lián)合用藥會(huì)產(chǎn)生更好的療效。

臨床型乳房炎造成的損失是顯而易見(jiàn)的；而隱性乳房炎由于缺乏明顯癥狀，常被人們所忽略。據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)奶牛業(yè)每年因乳房炎引起的損失達(dá)135億人民幣，其中70%的損失是來(lái)自隱性乳房炎引起的產(chǎn)奶量降低[7]。根據(jù)濰坊某奶牛場(chǎng)的實(shí)際情況，按照操作規(guī)程使用大小合適的杯組和運(yùn)行正常的設(shè)備進(jìn)行擠奶操作；擠奶時(shí)應(yīng)佩戴乳膠手套，消毒要及時(shí)；潮濕或被糞便污染的墊料應(yīng)及時(shí)清除，保持奶牛飼養(yǎng)環(huán)境的干凈、干燥；確保日糧中有足量的維生素E和硒；定期進(jìn)行奶牛隱性乳房炎的檢測(cè)，并進(jìn)行合理的藥物治療，可以有效的預(yù)防和治療奶牛乳房炎，降低病情的危害，提高企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。

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