吳微,楊柳,徐翊
1.長(zhǎng)江航運(yùn)總醫(yī)院,湖北 武漢 430010;2.武漢大學(xué)醫(yī)院,湖北 武漢 430071;3.武漢市第六醫(yī)院,湖北 武漢 430015
槲皮素對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響
吳微1,楊柳2,徐翊3
1.長(zhǎng)江航運(yùn)總醫(yī)院,湖北 武漢 430010;2.武漢大學(xué)醫(yī)院,湖北 武漢 430071;3.武漢市第六醫(yī)院,湖北 武漢 430015
目的觀察槲皮素對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)-12內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響,探討其作用機(jī)制。方法CCK-8法檢測(cè)不同濃度槲皮素和/或TGF-β1干預(yù)HUVEC-12 72 h后細(xì)胞活力;RT-PCR和免疫熒光雙染檢測(cè)內(nèi)皮及間質(zhì)標(biāo)記物的轉(zhuǎn)變;Western blot檢測(cè)信號(hào)通路;RT-PCR檢測(cè)在轉(zhuǎn)變過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)果RT-PCR和免疫熒光雙染結(jié)果均提示,TGF-β1(10 ng/mL)連續(xù)刺激HUVEC-12 72 h可誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞表型,表現(xiàn)出更多的間質(zhì)標(biāo)記物升高,內(nèi)皮標(biāo)記物降低;Western blot和RT-PCR結(jié)果顯示,槲皮素呈濃度依賴性抑制smad2/3的磷酸化;TGF-β1刺激后,下游調(diào)控內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要轉(zhuǎn)錄因子snail1、twist1、twist2、ZEB1、ZEB2均明顯升高,而100 μmol/L槲皮素則可顯著下調(diào)下游的5種轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)論槲皮素可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HUVEC-12發(fā)生內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化而發(fā)揮抗纖維化的作用。
槲皮素;內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化;臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞;纖維化
心室重構(gòu)過(guò)程中會(huì)發(fā)生心肌間質(zhì)纖維化,而間質(zhì)纖維化的主要特點(diǎn)為細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積和間質(zhì)細(xì)胞如肌成纖維細(xì)胞的增殖,進(jìn)而導(dǎo)致心肌組織毛細(xì)血管密度降低,心室順應(yīng)性也降低,最終心肌順應(yīng)性下降,導(dǎo)致心力衰竭。研究顯示,抗纖維化治療可明顯改善心力衰竭患者預(yù)后,在心肌纖維化進(jìn)程中,除固有的成纖維細(xì)胞會(huì)發(fā)生活化增殖外,內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、循環(huán)纖維細(xì)胞等均可通過(guò)一定機(jī)制轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞,抑制內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化可顯著改善心室重構(gòu)及心功能[1-2]。
槲皮素及其衍生物分布廣泛,現(xiàn)代藥理研究表明,其具有抗腫瘤、抗氧化、抗血小板聚集、保護(hù)心血管功能以及抗病毒的作用[3],具有抑制成纖維細(xì)胞增殖、抑制膠原合成、阻止氧化損傷、抑制血管生成等抗纖維化作用[4-5]。本實(shí)驗(yàn)觀察槲皮素對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)-12內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響,探討其作用機(jī)制。
1.1 藥物
槲皮素,購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司,純度≥99%,貨號(hào)117-39-5。
1.2 細(xì)胞
HUVEC-12,YRGene(NC006)。37 ℃、5.0%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞密度鋪滿80%培養(yǎng)皿底時(shí),采用0.25%胰酶消化后進(jìn)行傳代。對(duì)細(xì)胞采取刺激前,將培養(yǎng)細(xì)胞所用的培養(yǎng)基換為無(wú)血清培養(yǎng)基。
1.3 主要試劑與儀器
DMEM basic(1×)培養(yǎng)基、新生小牛血清(NBS)、胰酶,Gibco; CCK-8檢測(cè)試劑盒,日本同仁化學(xué)研究所;RT-PCR試劑盒,Roche;TGF-β1,PEPROTECH公司;ECGS,ScienCell公司;CD31、vimentin抗體,ABCAM公司;p-smad2、p-smad3、GAPDH,Cell Signaling Technology公司;smad2、smad3,Santa Curz公司;引物由上海生工合成。多功能微孔板檢測(cè)系統(tǒng)Synergy HT(美國(guó)BioTek),恒溫培養(yǎng)箱(日本SANYO),紫外分光光度計(jì)NANODROP 2000c(Thermo scientific),RT反轉(zhuǎn)錄儀Veriti 96 well Thermal Lycler(Applied Biosystems),實(shí)時(shí)定量PCR儀Light Lycler 480(美國(guó)Roche),倒置相差顯微鏡DP72(日本OLYMPUS)。
2.1 細(xì)胞處理及分組
待HUVEC細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)60%時(shí),棄去培養(yǎng)基,PBS清洗3次,加入無(wú)血清培養(yǎng)基,4 h后置換為含TGF-β1(10 ng/mL)無(wú)血清培養(yǎng)基,置于溫箱培養(yǎng),12 h換液1次,72 h后收取蛋白質(zhì)和RNA樣本。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、TGF-β1組、TGF-β1+槲皮素10 μmol/L組、TGF-β1+槲皮素50 μmol/L組、TGF-β1+槲皮素100 μmol/L組、槲皮素100 μmol/L組。
2.2 細(xì)胞毒性試驗(yàn)
細(xì)胞被接種至96孔板中,每孔100 μL,密度為2×105個(gè)/mL,置于溫箱培養(yǎng)24 h,將培養(yǎng)基更換為無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓6 h,干預(yù)72 h,將96孔板中培養(yǎng)基換為含有10 μL CCK-8無(wú)血清培養(yǎng)基100 μL,繼續(xù)孵育2~2.5 h,于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定光密度(OD)值。
2.3 RT-PCR檢測(cè)
細(xì)胞以不同因素處理后,棄去培養(yǎng)基,Trizol法提取細(xì)胞總RNA,紫外分光光度法測(cè)定其含量與純度。取大約5 μL總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以GAPDH為內(nèi)參,應(yīng)用20 μL體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件:94 ℃、2 min,1個(gè)循環(huán);94 ℃、40 s,25~35個(gè)循環(huán);50~65 ℃、40 s,72 ℃、1 min,72℃、5 min,1個(gè)循環(huán)。
2.4 Western blot檢測(cè)
細(xì)胞裂解液冰上裂解細(xì)胞10 min,手機(jī)并提取蛋白。校正GAPDH后,每組以校正后體積進(jìn)行10%SDS-PAGE凝膠電泳,后將蛋白以100 V、90 min轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用一抗封閉液(1∶1000)進(jìn)行封閉,然后用TBST洗膜,一抗孵育過(guò)夜后加入相對(duì)應(yīng)的二抗(1∶5000)行顯色反應(yīng)。應(yīng)用Odyssey圖像分析軟件檢測(cè)各組蛋白的相對(duì)密度值作為蛋白表達(dá)水平,均以GAPDH作為內(nèi)參。
2.5 免疫熒光雙染檢測(cè)
干預(yù)結(jié)束后,棄去培養(yǎng)基,PBS漂洗3次,4%多聚甲醛固定10 min,PBS漂洗3次,再以0.2%Triton通透細(xì)胞5 min,PBS漂洗3次,細(xì)胞爬片滴加25 μL 8%新生胎牛血清,置于濕盒內(nèi),置于37 ℃溫箱中孵育1 h,濾紙將封閉液吸干,滴加含有CD31/vimentin的一抗稀液(1∶200),置于4 ℃冰箱過(guò)夜,將濕盒取出置于37 ℃溫箱復(fù)溫1 h,將細(xì)胞爬片從24孔中取出,置于防脫切片上,滴加含有2種不同顏色的二抗(1∶2000),室溫下避光孵育1 h,PBS漂洗3次,DAPI封片置于正置熒光顯微鏡下觀察并拍照。
4.1 槲皮素對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞-12細(xì)胞活力的影響
干預(yù)72 h后,10、50、100 μmol/L槲皮素及其與TGF-β1的混合液對(duì)HUVEC-12細(xì)胞活力與未加任何處理因素的對(duì)照組比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。
4.2 槲皮素對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞-12發(fā)生內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響
槲皮素(10、50、100 μmol/L)與TGF-β1協(xié)同刺激HUVEC-12 72 h呈濃度依賴性抑制Ⅰ型膠原蛋
圖4 各組HUVEC-12 smads信號(hào)通路蛋白表達(dá)免疫印跡電泳圖
表4 各組HUVEC-12 smads信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較(±s,OD值)
表4 各組HUVEC-12 smads信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較(±s,OD值)
注:與對(duì)照組比較,*P<0.05;與TGF-β1組比較,#P<0.05
組別 劑量/(μmol/L) p-smad2 p-smad3對(duì)照組 1.00±0.07 1.00±0.08 TGF-β1組 2.55±0.26*2.53±0.25*TGF-β1+槲皮素組 10 2.14±0.19#1.92±0.18#TGF-β1+槲皮素組 50 1.64±0.18#1.54±0.15#TGF-β1+槲皮素組 100 1.26±0.19#1.19±0.09#槲皮素組 100 1.04±0.07 0.99±0.05
表5 各組HUVEC-12重要轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達(dá)比較(±s)
表5 各組HUVEC-12重要轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達(dá)比較(±s)
注:與對(duì)照組比較,*P<0.05;與TGF-β1組比較,#P<0.05
組別 劑量/(μmol/L) snail1 twist1 twist2 ZEB1 ZEB2對(duì)照組 1.00±0.10 1.00±0.11 1.00±0.08 1.00±0.09 1.00±0.11 TGF-β1組 1.78±0.28*3.11±0.41*3.99±0.36*3.02±0.37*3.10±0.25*TGF-β1+槲皮素組 100 1.21±0.18#1.96±0.19#1.89±0.25#1.67±0.19#1.78±0.14#槲皮素組 100 1.03±0.09 1.04±0.06 0.98±0.08 0.99±0.10 1.07±0.18
內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化機(jī)制轉(zhuǎn)化的成纖維細(xì)胞在心肌纖維化中發(fā)揮著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn),TGF-β1連續(xù)刺激HUVEC-12 72 h可誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞表型,表現(xiàn)出更多的間質(zhì)標(biāo)記物升高,而內(nèi)皮標(biāo)記物降低。Western blot結(jié)果顯示,槲皮素可能通過(guò)抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路以及其下游的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮抑制內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用。以上結(jié)果均提示,槲皮素可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HUVEC-12發(fā)生內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化而發(fā)揮抗纖維化的作用。
上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是上皮細(xì)胞失去上皮特性獲得間質(zhì)細(xì)胞表型的一種生物現(xiàn)象,發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化后細(xì)胞E-鈣黏蛋白、角蛋白等上皮標(biāo)記基因表達(dá)降低,vimentin、fibronectin、N-鈣黏蛋白等間質(zhì)標(biāo)記基因表達(dá)升高。研究表明,上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化參與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移,在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中,癌細(xì)胞通過(guò)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化而獲得間質(zhì)細(xì)胞表型和侵襲性,實(shí)現(xiàn)對(duì)周圍組織的浸潤(rùn),在種植部位,癌細(xì)胞通過(guò)間質(zhì)-上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化最終形成與原發(fā)灶形態(tài)結(jié)構(gòu)相似的轉(zhuǎn)移灶,內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的一種形式,近年來(lái),隨著對(duì)器官纖維化發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究逐步深入,內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化逐漸受到研究者的關(guān)注[6]。在器官纖維化進(jìn)展到一定階段時(shí),小血管內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣珊头置诠δ芑钴S的成纖維細(xì)胞,再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞,完成內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)變。Zeisberg E M等[2]于2007年首次發(fā)現(xiàn)在壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的小鼠心肌纖維化中,內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細(xì)胞,對(duì)心肌纖維化起到一定的促進(jìn)作用,抑制內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化則可顯著改善心肌功能,表明內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化對(duì)心肌纖維化具有重要作用。
本研究以TGF-β1誘導(dǎo)的HUVEC-12建立內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化模型,明確間質(zhì)微環(huán)境在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用,明確內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程與信號(hào)通路之間關(guān)系,采用10 ng/mL TGF-β1連續(xù)刺激HUVEC-12 72 h,細(xì)胞形態(tài)由鋪路石樣轉(zhuǎn)化為狹長(zhǎng)形的成纖維細(xì)胞性狀,細(xì)胞之間的連接也從緊密連接轉(zhuǎn)換為松散連接,細(xì)胞間縫隙增大,RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,間質(zhì)標(biāo)記物Collagen Ⅰ、α-SMA、vimentin、fibronectin均表達(dá)上調(diào),而內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31則表達(dá)下調(diào),由此可以判斷TGF-β1可誘導(dǎo)HUVEC-12發(fā)生內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化,而TGF-β1與槲皮素同時(shí)干預(yù)HUVEC-12 72 h則可呈濃度依賴性逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象,上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物,下調(diào)間質(zhì)標(biāo)記物,免疫熒光雙染結(jié)果也得到同樣結(jié)果。內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的內(nèi)皮細(xì)胞獲得具有遷移和侵襲能力間質(zhì)細(xì)胞的重要生物學(xué)過(guò)程。因而,闡明調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程的分子機(jī)制,明確其在心肌纖維化發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的病理意義,并探索基于內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化關(guān)鍵分子的診斷方法及靶向內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化關(guān)鍵分子的治療手段是心肌纖維化中內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化機(jī)制研究的關(guān)鍵問(wèn)題。
TGF-β1/Smads信號(hào)通路及其下游的一些轉(zhuǎn)錄因子在心臟內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用,這些包括snail和twist鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族成員以及ZEB家族[7-9]。本研究檢測(cè)了TGF-β1/smads信號(hào)通路及其下游的靶分子的表達(dá),包括snail1、twist1、twist2、ZEB1、ZEB2,結(jié)果發(fā)現(xiàn),TGF-β1刺激HUVEC-12 24 h可顯著引起smad信號(hào)通路的磷酸化水平升高,其下游的靶分子snail1、twist1、twist2、ZEB1、ZEB2均表達(dá)上調(diào),而TGF-β1與槲皮素(100 μmol/L)聯(lián)合作用時(shí),則可顯著降低smad信號(hào)通路的磷酸化水平以及抑制其下游的靶分子。因此,我們認(rèn)為槲皮素可能通過(guò)抑制TGF-β1/smads信號(hào)通路以及其下游的靶分子表達(dá)抑制HUVEC-12發(fā)生內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。
槲皮素作用機(jī)制復(fù)雜,幾乎涉及組織器官纖維化的各個(gè)環(huán)節(jié):①抑制成纖維細(xì)胞增殖;②抑制膠原合成;③抗氧化損傷;④抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng),抑制血管形成;⑤影響細(xì)胞周期,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明,槲皮素可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HUVEC-12發(fā)生內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化環(huán)節(jié),為進(jìn)一步探討槲皮素的臨床治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。此外,本研究也探討了槲皮素對(duì)內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用并鑒定其可能作用的信號(hào)通路及轉(zhuǎn)錄因子,但未能闡明其具體的作用機(jī)制,也未能在大體動(dòng)物模型中進(jìn)一步驗(yàn)證,有待進(jìn)一步完善相關(guān)實(shí)驗(yàn),明確其作用機(jī)制。
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(修回日期:2016-03-26;編輯:華強(qiáng))
Effects of Quercetin on Human Umbilical Vein Endothelial Cell Undergoing Endothelial-to-mesenchymal Transition Induced by TGF-β1
WU Wei1, YANG Liu2, XU Yi3
(1. General Hospital of the Yangtze River Shipping, Wuhan 430010, China; 2. The Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, China; 3. Sixth Hospital of Wuhan, Wuhan 430015, China)
ObjectiveTo investigate the effectsof quercetin on human umbilical vein endothelial cell (HUVEC)-12 undergoing endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) induced by TGF-β1; To discuss its mechanism of action.MethodsCell activity of intervening by quercetin with different concentrations and TGF-β1 for 72 h was detected by CCK-8 method; RT-PCR and immunofluorescence staining were used to detect the transition of endothelial and stromal markers; Western blot was used to detect the signal transduction pathway; RT-PCR was performed to detect the transcription factors that play crucial roles in the process of transformation.ResultsThe results of RT-PCR and immunofluorescence double staining showed that TGF-β1 (10 ng/mL) stimulated HUVEC-12 cells for 72 h to induce fibroblast phenotype, showing more interstitial markers and less endothelial markers; Western blot and RT-PCR results showed that quercetin inhibited the phosphorylation of smad2/3 in a concentration-dependent manner; After TGF-β1 stimulation, the downstream transcription factors EndMT of snail1, twist1, twist2, ZEB1, and ZEB2 significantly increased, while 100 μmol/L quercetin could down-regulate the five downstream transcription factors.ConclusionQuercetin has anti-fibrosis effects through inhibiting HUVEC-12 cells undergoing EndMT.
quercetin; endothelial-to-mesenchymal transition; umbilical vein endothelial cell; fibrosis
R285.5
A
1005-5304(2017)02-0065-05
2016-03-01)
DOl:10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.017