范海濤 馮樹強(qiáng) 張 明 田文杰 楊 瀟

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科,吉林 長(zhǎng)春 130041)

siVEGF增敏吉西他濱對(duì)人膀胱癌小鼠移植瘤的治療作用

范海濤 馮樹強(qiáng) 張 明 田文杰 楊 瀟

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科,吉林 長(zhǎng)春 130041)

目的 探討血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子小干擾RNA(siVEGF)增敏吉西他濱(GEM)對(duì)人膀胱癌T24細(xì)胞株在小鼠膀胱成瘤情況的影響及其對(duì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的治療作用。方法 采用細(xì)胞移植法分別把經(jīng)過處理(治療組)和未經(jīng)過處理(對(duì)照組)的T24細(xì)胞接種到小鼠膀胱內(nèi)，然后用256排極速CT定期檢測(cè)，并在28 d時(shí)處死動(dòng)物稱瘤重量，測(cè)定瘤體積，進(jìn)行組織病理學(xué)和細(xì)胞學(xué)檢查。結(jié)果 治療組和對(duì)照組的成瘤率分別為40%(6/15)和93%(14/15)，治療組瘤細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。兩組腫瘤重量和體積比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。組織病理學(xué)和細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果顯示，治療組移植瘤細(xì)胞增殖能力減弱，惡性度下降，瘤細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)降低，而對(duì)照組則未出現(xiàn)相應(yīng)的變化。結(jié)論 模擬人的小鼠膀胱癌原位模型更接近人體膀胱腫瘤的微環(huán)境和向膀胱腔內(nèi)生長(zhǎng)的特征，故更適合臨床膀胱癌的治療研究。推測(cè)靶向基因治療聯(lián)合細(xì)胞毒藥物的化療策略極有可能為提升目前臨床膀胱癌的治療水平和提高膀胱癌病人的生存率帶來幫助。

膀胱腫瘤；基因治療；細(xì)胞毒藥物

腫瘤微環(huán)境對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著至關(guān)重要的影響。研究膀胱癌的理想動(dòng)物模型除應(yīng)與人體膀胱癌在組織結(jié)構(gòu)和生物學(xué)行為上相似外，腫瘤還應(yīng)生長(zhǎng)在膀胱腔內(nèi)(原位生長(zhǎng))〔1,2〕。本實(shí)驗(yàn)選用小鼠，把經(jīng)過血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子小干擾RNA(siVEGF)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染并在其內(nèi)加進(jìn)細(xì)胞毒藥物吉西他濱(GEM)的人膀胱癌T24細(xì)胞和未經(jīng)上述處理的人膀胱癌T24細(xì)胞分別接種到小鼠膀胱內(nèi)，通過CT定期檢測(cè)兩種細(xì)胞的成瘤情況，通過腫瘤組織標(biāo)本檢測(cè)瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。

1 材料與方法

1.1 一般材料 人膀胱癌細(xì)胞T24購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。siVEGF表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的T24細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并傳代保存〔3〕。GEM來自江蘇豪森藥物有限公司。小鼠購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，雌性30只，平均體重(150±72)g，飼養(yǎng)于恒定溫度(25℃～27℃)、恒定濕度(40%～50%)的SPF層流室中。

1.2 建立動(dòng)物模型 按照參考文獻(xiàn)〔4〕建立人膀胱癌小鼠原位膀胱腫瘤模型。苯巴比妥鈉麻醉(30 mg/kg),無菌條件下8號(hào)導(dǎo)尿管通過尿道插入膀胱，100 μl 0.1 mol/L HCl處理后注入100 μl 0.1 mol/L KOH中和，磷酸鹽緩沖液沖洗，分別注入經(jīng)siVEGF表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染+GEM處理(治療組)和未經(jīng)同樣處理(對(duì)照組)的T24細(xì)胞，濃度為每150 μl含1.5×106個(gè)細(xì)胞的平衡液(HBSS)，在膀胱內(nèi)保留1 h后分別使小鼠仰臥和左右側(cè)變換體位共4次，30 min/次，以使HBSS液與整個(gè)膀胱腔黏膜充分接觸，2 h后拔管，備檢。

1.3 采用256排極速CT檢測(cè)小鼠膀胱成瘤情況 小鼠被麻醉后仰臥固定，經(jīng)導(dǎo)管注入450 μl NaCl，以間距1 mm、層厚1.5 mm掃描成像。

1.4 組織病理學(xué)和細(xì)胞學(xué)檢查 對(duì)成瘤的21只小鼠在細(xì)胞移植后第28天處死并實(shí)時(shí)解剖，完整剝離出瘤塊，用游標(biāo)卡尺測(cè)定腫瘤大小并稱重，顯微鏡觀察確認(rèn)瘤細(xì)胞分級(jí)和瘤細(xì)胞生長(zhǎng)浸潤(rùn)狀況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠成瘤狀況 對(duì)照組在T24細(xì)胞移植后第7天出現(xiàn)腫瘤，而治療組第13天才檢測(cè)到腫瘤，第28天時(shí)處死所有成瘤小鼠，切取腫瘤稱重并計(jì)算瘤體積。對(duì)照組小鼠腫瘤重量為(3.9±0.7)g，體積(1895±273)mm3；治療組分別為(2.3±0.6)g，(1 207±148)mm3，兩組瘤重和瘤體積比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明siVEGF和GEM聯(lián)用對(duì)腫瘤生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。對(duì)照組和治療組的成瘤率分別為93%和40%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 小鼠成瘤模型生長(zhǎng)變化 CT檢測(cè)對(duì)照組和治療組，分別在T24細(xì)胞移植后第7天和第13天見到腫瘤結(jié)節(jié)，隨著時(shí)間的延后，腫瘤向膀胱腔內(nèi)生長(zhǎng)和向黏膜下浸潤(rùn)現(xiàn)象愈加明顯，提示瘤細(xì)胞增殖能力逐漸增強(qiáng)，惡性度逐漸增大，這種變化與處死后動(dòng)物的組織病理學(xué)檢查結(jié)果相吻合。

2.3 細(xì)胞學(xué)檢查 移植的人膀胱癌細(xì)胞株T24特征包括有絲分裂相、高核質(zhì)比和多型核，這些與未移植前的T24細(xì)胞幾乎一致。以中度分化為主的細(xì)胞多向腔內(nèi)生長(zhǎng)，而以低分化為主的細(xì)胞則多向黏膜層呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)。腫瘤細(xì)胞分級(jí)(按世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn))：對(duì)照組G1級(jí)5只，G2級(jí)8只，G3級(jí)2只；治療組G1級(jí)4只，G2級(jí)2只。臨床病理分期(按國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn))：對(duì)照組T1期3只，T2期9只，T3期3只；治療組T1期4只，T2期2只。提示治療組瘤細(xì)胞惡性程度降低，浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移能力減弱；而對(duì)照組瘤細(xì)胞惡性度依舊，其固有的惡性特征——浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的能力沒有改變。

3 討 論

本文按照參考文獻(xiàn)〔4〕所述方法步驟建立的小鼠膀胱癌原位動(dòng)物模型與人體膀胱癌的發(fā)生發(fā)展過程以及生物學(xué)行為大體一致，從原位癌的發(fā)生、生長(zhǎng)、浸潤(rùn)以及轉(zhuǎn)移的全過程中，可以捕捉到膀胱癌發(fā)生發(fā)展的一些生物學(xué)行為規(guī)律，更適合新抗癌制劑治療效果的客觀評(píng)價(jià)。與非原位模型(例如：皮下移植瘤)相比，原位膀胱癌動(dòng)物模型能更好地模擬人膀胱癌的生物學(xué)行為。隨著動(dòng)物膀胱癌原位模型逐漸成熟，其應(yīng)用空間也擴(kuò)大到了藥物開發(fā)、藥物臨床試驗(yàn)〔5〕。這為更好地開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，亦將為推廣在臨床實(shí)際應(yīng)用提供強(qiáng)有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。由于本實(shí)驗(yàn)選用小鼠構(gòu)建的動(dòng)物原位膀胱腫瘤模型有別于以往的皮下移植瘤，也更優(yōu)于不具有免疫功能的裸鼠腫瘤模型，故這可能更適合人類膀胱腫瘤的治療研究。

本研究結(jié)果亦顯示，動(dòng)物膀胱癌原位模型能較好地模擬人的膀胱癌生長(zhǎng)方式，因此被廣泛認(rèn)為不僅是觀察評(píng)價(jià)抗癌生物制劑和抗癌化學(xué)藥物的理想方法，而且對(duì)進(jìn)一步闡明人體膀胱癌的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移，甚至治療后復(fù)發(fā)的機(jī)制也有一定幫助。另外，由于膀胱獨(dú)特的解剖特點(diǎn)，經(jīng)尿道直接灌注藥物治療膀胱癌的方法是目前公認(rèn)的優(yōu)于其他給藥途徑的方法。這是因?yàn)槭紫冉o藥方便，保留時(shí)間易于人為控制，能使藥物發(fā)揮并達(dá)到最佳的治療效果；其次藥物無須穿過血管屏障及腫瘤局部的高組織間隙壓力屏障，這大大提高了藥物與靶細(xì)胞的結(jié)合率；最后避免了血液循環(huán)系統(tǒng)對(duì)藥物的稀釋和非特異性攝取導(dǎo)致的藥量有效濃度遞減和可能誘發(fā)的損傷性免疫反應(yīng)。故建立動(dòng)物小鼠膀胱癌原位模型并進(jìn)行治療實(shí)驗(yàn)將成為基礎(chǔ)與臨床研究的重要方面和相互連接的橋梁。

另外，本文數(shù)據(jù)表明， siVEGF+GEM治療使人膀胱癌細(xì)胞株T24在小鼠膀胱內(nèi)成瘤率低，生長(zhǎng)緩慢，惡性度降低，浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移能力減弱，這與以往的單純基因治療效果相比〔6,7〕似有更大優(yōu)勢(shì)。也許抗血管生成的基因靶向治療和細(xì)胞毒藥物的化療聯(lián)合治療方案將為提高目前膀胱癌的治療水平和病人的5年生存率帶來新的幫助〔8,9〕。

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3 范海濤，楊 瀟，郭 航，等.VEGF siRNA和吉西他濱聯(lián)用對(duì)膀胱尿路上皮癌T24細(xì)胞株增殖和凋亡的影響〔J〕.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2016;20(11):1830- 3.

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〔2017- 05- 11修回〕

(編輯 袁左鳴)

吉林省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.20150101195JC)

張 明(1963- )，男，主任醫(yī)師，主要從事泌尿系統(tǒng)腫瘤的防治研究。

范海濤(1974- )，男，副教授，博士，主要從事膀胱腫瘤的防治研究。

R737.14

A

1005- 9202(2017)15- 3648- 02；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.004