胡晶晶 陳小云 周偉 劉福興

(湖北省鐘祥市人民醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 鐘祥 431900)

瑞舒伐他汀后處理通過抑制高遷移率族蛋白表達(dá)減輕心肌缺血再灌注損傷的研究

胡晶晶△陳小云 周偉 劉福興

(湖北省鐘祥市人民醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 鐘祥 431900)

目的 研究瑞舒伐他汀(RS)后處理是否可以通過抑制高遷移率族蛋白(HMGB1)的表達(dá)減輕心肌缺血再灌注損傷(I/R)。方法 使用SD大鼠缺血再灌注模型，缺血30 min，再灌4 h。將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=10)、缺血再灌注組(n=15)和RS后處理組(n=15) 三組，檢測(cè)血清中乳酸脫氫酶(LDH)水平和肌酸激酶(CK)活性、心肌組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平及心肌梗死面積和心肌中HMGB1的表達(dá)水平。結(jié)果 RS后處理能明顯減少梗死面積(P<0.05)及LDH、CK活性(P均<0.05)；明顯抑制MDA的升高和SOD的活性(P均<0.05)；明顯抑制HMGB1的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論 RS后處理對(duì)心肌I/R的保護(hù)作用與抑制HMGB1的表達(dá)有關(guān)。

瑞舒伐他汀； 高遷移率族蛋白； 心肌缺血再灌注損傷

高遷移率族蛋白(HMGB1)是一種非組織核蛋白，它可以由壞死和凋亡細(xì)胞被動(dòng)釋放，也可以由活化的先天免疫細(xì)胞(包括巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞)主動(dòng)釋放?，F(xiàn)已證實(shí)HMGB1在多種心血管疾病中有促炎作用，包括心肌缺血再灌注損傷(I/R)[1-4]。HMGB1既可以像經(jīng)典的炎癥因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素6(IL-6)一樣，作為促炎因子加重心肌I/R損傷，同時(shí)也可以促進(jìn)TNF-α和IL-6的釋放。然而，HMGB1的特異性拮抗劑卻可以減弱心肌I/R損傷并抑制TNF-α和IL-6的表達(dá)。目前認(rèn)為，炎癥反應(yīng)在心肌I/R損傷中起關(guān)鍵作用[5-6]。這些結(jié)果均證實(shí)，HMGB1在心肌I/R損傷中有重要作用。瑞舒伐他汀(RS)是一種3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，可以減少膽固醇生成。前期研究已證實(shí)，RS預(yù)處理有心肌保護(hù)作用，如減少心肌I/R損傷[7-11]。但是，RS后處理對(duì)心肌I/R損傷是否有保護(hù)作用以及其中機(jī)制尚不清楚。研究證實(shí)，他汀類藥物可以抑制HMGB1的表達(dá)[12-13]。本研究試用大鼠心肌I/R模型，探討RS后處理是否可以通過抑制HMGB1表達(dá)減輕心肌I/R損傷。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠購于武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 分組 雄性SD大鼠(250～300g)隨機(jī)分為三組：(1)假手術(shù)組(SO，n=10)：僅開胸，不結(jié)扎大鼠前降支；(2)缺血再灌注組(I/R,n=15)：開胸后結(jié)扎大鼠前降支30 min，再灌4 h。(3)RS后處理+缺血再灌注組(RS+I/R,n=15)：開胸后結(jié)扎大鼠前降支30 min，再灌4 h，RS溶于生理鹽水，再灌前5 min靜脈注射RS(10mg/kg)[9, 13]。

1.3 建立大鼠心肌缺血再灌注模型 苯巴比妥鈉麻醉(40 mg/kg, i.p.)；氣管插管(70次/min，吸呼比1∶1.5)，缺血前給予肝素(200 IU/kg, i.v.)；記錄心電圖(LEAD2000B)。左側(cè)胸骨旁切口開胸，5-0線結(jié)扎大鼠前降支終端。心電圖ST段抬高提示缺血成功，缺血30 min后再灌4 h。

1.4 心梗面積測(cè)定 梗死面積用TTC染色法標(biāo)記。再灌注4 h后，再次結(jié)扎前降支并經(jīng)股靜脈注射2 mL Evans藍(lán)。取心臟并將其切為5張薄片，用1%TTC在37℃條件下孵育15 min。用圖片分析器((Image-Pro Plus 3.0, Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA)統(tǒng)計(jì)梗死區(qū)(白色)和缺血區(qū)(紅色和白色)。梗死面積用百分比表示，梗死區(qū)/缺血區(qū)×100%。

1.5 心肌酶測(cè)定 測(cè)定血清中LDH水平和CK活性。使用商業(yè)化試劑盒(南京，建成生物工程研究所)，根據(jù)說明規(guī)范操作測(cè)定。測(cè)量值以國際標(biāo)準(zhǔn)化單位U/L表示。

1.6 心肌MDA水平和SOD活性的測(cè)定 分別采用MDA試劑盒和SOD試劑盒(南京建成生物研究所)根據(jù)操作說明規(guī)范操作，檢測(cè)心肌組織中MDA水平和SOD活性。MDA反映了氧自由基的水平，SOD反映了心肌組織中脂質(zhì)超氧化水平。

1.7 左室缺血區(qū)心肌組織HMGB1的表達(dá)量的測(cè)定 如前所述[13]，用免疫印跡法定量測(cè)量左室缺血區(qū)心肌組織HMGB1的表達(dá)量，以表達(dá)量與甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的標(biāo)準(zhǔn)化比值計(jì)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。所有統(tǒng)計(jì)量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間用單因素方差分析，多重比較采用Tukey檢測(cè)法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 心梗面積 與I/R組相比，RS后處理組心梗面積明顯減少(28.9±3.7% vs. 52.8±4.4%,P<0.05)。

2.2 LDH和CK活性 與假手術(shù)組相比，I/R組血清中LDH和CK活性明顯增加(P<0.05)，而RS后處理可以減小血清中LDH和CK的增加幅度(P<0.05)。見表1。

2.3 MDA水平和SOD活性 與假手術(shù)組相比，I/R組心肌組織中MDA水平明顯增高，而SOD活性卻明顯降低(P<0.05)。RS后處理明顯抑制了MDA水平的增高和SOD水平的減低(P<0.05 )。見表1。

2.4 HMGB1的表達(dá) 如表1所示，I/R使心肌組織中HMGB1的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，RS后處理可以減少HMGB1的升高幅度(P<0.05)。

表1 缺血再灌注及瑞舒伐他汀對(duì)LDH、CK、MDA、SOD和HMGB1表達(dá)的影響

注：與SO組比較，*P<0.05，與I/R組比較，#P<0.05。

3 討 論

前期很多的研究已經(jīng)證實(shí)，他汀類藥物具有心肌保護(hù)作用，表現(xiàn)為在急性心梗和心肌缺血再灌注中心肌梗死面積的減少，且這種保護(hù)作用不僅僅依賴于他汀的降脂作用[14]。與其它親脂他汀相比，RS相對(duì)親水，它通過擴(kuò)散結(jié)合到多種細(xì)胞的胞膜上，從而減少胞膜對(duì)其它分子的吸附力。RS在肝細(xì)胞和可以主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)陰離子復(fù)合物的細(xì)胞，吸收率非常高。正是由于這種特性，RS對(duì)活化的HMG-CoA還原酶的親和力高于其它他汀類藥物。已經(jīng)證實(shí)，RS有心臟保護(hù)作用，包括心肌I/R損傷的保護(hù)作用[7-11]：Jones等提出RS預(yù)處理可以通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性一氧化氮(NO)的產(chǎn)生，減輕心肌I/R損傷；Ke等證實(shí)RS預(yù)處理可以減少心肌I/R中炎癥細(xì)胞聚集和心肌梗死面積；近期，Burma等進(jìn)一步證實(shí)RS可以通過抑制炎癥反應(yīng)，改善內(nèi)皮功能和減輕氧化應(yīng)激保護(hù)心肌I/R損傷。本研究證實(shí)，RS后處理可以減少心肌I/R損傷和心肌組織中HMGB1的表達(dá)。前期的研究已經(jīng)證實(shí)HMGB1是心肌I/R損傷的重要促炎因子[6]，且炎癥在心肌I/R損傷中起關(guān)鍵作用[5-6]。所以我們認(rèn)為，RS后處理可以通過減少HMGB1表達(dá)減輕心肌I/R損傷。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)，RS后處理可以降低MDA水平，增加SOD活性。前期研究表明活性氧可能也參與了HMGB1的釋放。Tang等[15]研究表明，過氧化氫(活性氧的一種)可以刺激巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞主動(dòng)分泌HMGB1。Tsung等[16]通過肝細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)一步證實(shí)，活性氧可以調(diào)控HMGB1的表達(dá)，抑制活性氧可能會(huì)抑制HMGB1的表達(dá)。這些結(jié)果均提示，RS后處理可能是通過抑制心肌I/R中活性氧的產(chǎn)生減少HMGB1的表達(dá)。

本研究僅探討了RS后處理與心肌I/R和HMGB1表達(dá)的關(guān)系，對(duì)于具體的作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究；本研究證實(shí)，RS后處理可以減輕心肌I/R損傷，這種保護(hù)作用可能與抑制HMGB1的表達(dá)有關(guān)。提示在臨床實(shí)踐中，也許可以應(yīng)用RS來減輕心肌I/R損傷。

[1] Andrassy M, Volz HC, Igwe JC, et al. High-mobility group box-1 in ischemia-reperfusion injury of the heart [J]. Circulation,2008,117: 3216-3226.

[2] Mersmann J, Iskandar F, Latsch K, et al. Attenuation of myocardial injury by HMGB1 blockade during ischemia/reperfusion is toll-like receptor 2-dependent [J]. Mediators Inflamm,2013:174168.

[3] Wang J, Hu X, Xie J, et al. Selectively stimulating β1-adrenergic receptor attenuates rat myocardial ischemia/reperfusion injury in vivo by inhibiting high mobility group box 1 protein release [J]. Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi,2014,42(8):680-685.

[4] Hu X, Xu W, Jiang H. HMGB1/IL-17A axis: an important mechanism for myocardial ischemia-reperfusion injury [J]. Int J Cardiol,2014,174(2):447-448.

[5] Frangoginis NG, Smith CW and Entman ML: The inflammatory response in myocardial infarction [J]. Cardiovasc Res,2002,53: 31-47.

[6] Hu X, Fu W and Jiang H:HMGB1:a potential therapeutic target for myocardial ischemia and reperfusion injury [J]. Int J Cardiol,2012, 155: 489.

[7] Jones SP, Gibson MF, Rimmer DM III, et al: Direct vascular and cardioprotective effects of rosuvastatin, a new HMG-CoA reductase inhibitor [J]. J Am Coll Cardiol,2002,40:1172-1178.

[8] Ke D, Fang J, Fan L, et al: Regulatory T cells contribute to rosu-vastatin-induced cardioprotection against ischemia-reperfusion injury [J]. Coron Artery Dis,2013,24:334-341.

[9] Liuni A, Luca MC, Gori T, et al. Rosuvastatin prevents conduit artery endothelial dysfunction induced by ischemia and reperfusion by a cyclooxygenase-2-dependent mechanism [J]. J Am coll cardiol, 2010, 55(10): 1002-1006.

[10] Ke D, Fang J, Fan L, et al. Regulatory T cells contribute to rosuvastatin-induced cardioprotection against ischemia-reperfusion injury [J]. Coron Artery Dis,2013,24(4):334-341.

[11] Burma O, Onat E, Uysal A, et al. Effects of rosuvastatin on ADMA, rhokinase, NADPH oxidase, caveolin-1, hsp 90 and NFkB levels in a rat model of myocardial ischaemia-reperfusion[J]. Cardiovasc J Afr,2014,25(5):212-216.

[12] Wang L, Zhang X, Liu L, et al: Atorvastatin protects rat brains against permanent focal ischemia and downregulates HMGB1, HMGB1 receptors (RAGE and TLR4), NF-kappaB expression [J]. Neurosci Lett,2010,471:152-156.

[13] Jin D, Wu Y, Zhao L, et al: Atorvastatin inhibits serum HMGB1 level in patients with hyperlipidemia [J]. Exp Ther Med, 2012,4:1124-1126.

[14] Adameova A, Harcarova A, Matejikova J, et al. Simvastatin alle-viates myocardial contractile dysfunction and lethal ischemic injury in rat heart independent of cholesterol-lowering effects [J]. Physiol Res,2009,58: 449-454.

[15] Tang D, Shi Y, Kang R, et al: Hydrogen peroxide stimulates macrophages and monocytes to actively release HMGB1 [J]. J Leukoc Biol,2007,81:741-747.

[16] Tsung A, Klune JR, Zhang X, et al: HMGB1 release induced by liver ischemia involves Toll-like receptor 4 depedent reactive oxygen species production and calcium-mediated signaling [J]. J Exp Med,2007,204:2913-2923.

Study on the rosuvastatin post-condition reduces myocardial ischemia and reperfusion injury via inhibiting HMGB1 expression

HuJingjing,ChenXiaoyun,ZhouWei,LiuFuxing.

DepartmentofCardiology,ZhongxiangCityPeople'sHospital,Zhongxiang430060,Hubei,China.

Objective To investigate whether rosuvastatin post-condition could reduce myocardial I/R injury via inhibiting the expression of HMGB1. Methods Rats were randomly divided into 3 groups which were sham operate group (SO,n=10), ischemia/reperfusion group (I/R,n=15), post-condition with rosuvastatin + ischmia/reperfusion group (RS+I/R,n=15). Serum Lactate dehydrogenase (LDH), creatine kinase (CK), myocardial tissue infarct size, superoxide dismutase (SOD) activities, malondialdehyde (MDA) levels and high mobility group box 1 protein (HMGB1) expression were tested. Results Infarct size in myocardial tissue(28.9±3.7 vs. 52.8±4.4%)and the activities of LDH and CK in serum were significantly reduced by rosuvastatin post-condition(LDH(U/L)was 1389.4±103.7 vs 2301.6±117.4, CK(U/L) was 1390.5±96.5 vs 2402.3±130.2, and AllP<0.05), the same with the MDA production(5.84±0.36 vs 10.98±0.83) SOD activity (157.1±9.51 vs 90.12±4.48)and HMGB1 expression (0.267±0.024 vs 0.927±0.117) in myocardial tissue (all P<0.05). Conclusion Rosuvastatin can reduce myocardial I/R injury via inhibiting the expression of HMGB1.

Rosuvastatin； HMGB1； Myocardial I/R injury

R-332

A

1000-744X(2016)08-0798-03

2016-03-19)

△通信作者，E-mail：hujjzxh@163.com