羅 璋，羅季委，李海錦，賀巨炬，彭 旺，李潤成，余興龍，肖朝庭

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙410128；2.湖南大學(xué)生物學(xué)院，湖南長沙410082）

豬星狀病毒2型PCR檢測分型方法的建立及初步應(yīng)用

羅 璋1，羅季委1，李海錦1，賀巨炬1，彭 旺1，李潤成1，余興龍1，肖朝庭2※

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙410128；2.湖南大學(xué)生物學(xué)院，湖南長沙410082）

根據(jù)GenBank登的豬星狀病毒2型（PAstV2）序列，設(shè)計1對引物。通過優(yōu)化反應(yīng)條件，首次在湖南地區(qū)檢測到PAstV2型病毒。用該方法通過提取樣品RNA，采用RT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增，得到一條預(yù)期的特異性條帶（243bp），將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，結(jié)果表明該序列與PAstV2型的參考序列同源性為96％。同時，用該引物檢測可引起腹瀉的PEDV、TGEV、CSFV和PRRSV四種病毒RNA，RT-PCR結(jié)果均為陰性。該RT-PCR的敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明其最高敏感度為400 pg/μL。采用該方法對湖南境內(nèi)78份豬腸道和糞便樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)PAstV2型的感染率達(dá)到11.5％（9/78）。結(jié)果表明該方法可以應(yīng)用于臨床PAstV2檢測。

豬星狀病毒；基因型；PCR；PAstV2

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與病料

豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和豬流行性腹瀉病毒（PEDV）由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室保存；豬瘟病毒（CSFV）和豬藍(lán)耳病病毒（PRRSV）來自于普萊科生物疫苗毒；78份豬糞便和腸道收集于湖南不同地區(qū)的豬場。

1.1.2 主要試劑

RNA抽提試劑Trizo1Reagent購自Invitrogen公司；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit購自Fermentas公司；Taq DNA聚合酶Mix購自天恩澤生物有限公司；無R N A酶水購自生工生物工程有限公司，其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)，分析純。

1.1.3 樣品處理

取病豬的糞便0.2g，加入1mL無RNA酶水，用旋渦混合儀震蕩混勻后，放入高速臺式冷凍離心機(jī)12 000r/min離心5min，取上清液至-20℃冰箱貯存。

1.1.5 RNA的提取與cDNA的合成

取150μL樣品加入1mL Trizo1，震蕩搖晃，加入250μL氯仿，靜置15min，于4℃12 000r/min離心10min。取上清液加入250μL異丙醇，混勻，于4℃12 000r/min離心6min。棄上清，加入無水乙醇300μL，混勻，于4℃12 000r/min離心3min。棄上清，加入300μL無RNA酶水，溶解RNA。取1μL RNA至PCR管，并加入RNase Free H2O 10μL、5× RT Buffer 4μL、10mM dNTPs 2μL、Random primer 1μL、RNase Inhibitor 1μL、Reverse Transcriptase 1μL，共20μL體系。反應(yīng)條件：25℃、20min，42℃、45min，72℃、5min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.6 引物設(shè)計及合成

根據(jù)GenBank上PAstV2(JX556690)基因序列，用Primer5.0軟件設(shè)計一對特異性引物（表1）。引物由華大基因公司合成。

表1 引物序列

1.2 方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化

以PAstV2的cDNA為模板建立PCR反應(yīng)體系，共18.1μL：Taq DNA聚合酶Mix 8μL，PAstV2 Forward Primer 0.3μL，PAstV2 Reverse Primer 0.3μL，模板1.5μL，雙蒸水8μL。改變遞減PCR循環(huán)中的退火溫度：95℃5min；95℃30s,（63℃、61℃、59℃、57℃、55℃）30s，72℃30s（35個循環(huán)）；72℃5min 15℃保存。固定擴(kuò)增效果最佳的退火溫度，改變反應(yīng)體系中引物的比例，最后根據(jù)1.2％瓊脂糖凝膠電泳效果逐步篩選出最佳退火溫度，同時將剩余的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送華大基因測序。

1.2.2 PCR方法的特異性試驗(yàn)

利用建立的PCR方法分別對PEDV、TGEV、PRRSV、CSFV及PAstV的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時用ddH2O作為陰性對照檢測。

1.2.3 PCR方法的敏感性試驗(yàn)

選取PAstV2型檢測為陽性的RNA模板，反轉(zhuǎn)錄后用分光光度計測量其cDNA濃度并將其濃度稀釋到400ng/μL，再將其濃度分別稀釋到40ng/μL、4ng/μL、400pg/μL和40pg/μL，同時設(shè)陰性對照，檢查該方法的敏感性。

1.2.4 PCR方法的初步應(yīng)用

利用建立的PCR方法對來自湖南的78份腸道和糞便樣品進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化

篩選出最佳退火溫度為57℃。擴(kuò)增出一條243bp條帶，與預(yù)期條帶相符（圖1）。測序結(jié)果為：accctatctgatgccacagtgagaccatcctttcaaggaatacattgaaaaatgc cttgccgccctcgagaccgggcgcaccttgcctaaaatcactgatgagcagct ggatcgtctttggaggggaggaccaaagacagcatctaatggctaatcgccagc agaagcgtggtccacgcactacgaccaacatcgtggtgcgcaatggaa。

將測序結(jié)果進(jìn)行B1ast序列比對，發(fā)現(xiàn)與豬星狀病毒2型參考序列JX556690的同源性為96％。

（N：陰性對照；1、2：PASTV2；M：DL2000DNAMarker）圖1 PCR試驗(yàn)擴(kuò)增結(jié)果

2.2 PCR方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果

利用建立的PCR方法分別對PEDV、TGEV、CSFV及PRRSV的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時用ddH2O作為陰性對照檢測，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2％瓊脂凝膠電泳檢測。結(jié)果顯示，PEDV、TGEV、CSFV、PRRSV及陰性對照沒有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，只有PAstV2出現(xiàn)了預(yù)期的目的條帶（243bp）（圖2）。

（N：陰性對照；1：PEDV；2：TGEV；3：CSFV；4：PRRSV；5：PAstV2；M：DL2000DNAMarker）圖2 PCR方法特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 PCR方法的敏感試驗(yàn)結(jié)果

用優(yōu)化的PCR方法對PAstV基因2型不同濃度的cDNA進(jìn)行核算擴(kuò)增。結(jié)果表明，該方法檢測PAstV2的最高敏感度在400pg/μL，敏感性良好。（圖3）。

N：陰性對照；1：40pg/μL，2：400pg/μL，3：4ng/μL，4：40ng/μL，5：400ng/μL，M：DL2000DNAMarker）圖3 PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 PCR方法的初步應(yīng)用

用建立的PCR方法對來自湖南的78份腸道和糞便樣品進(jìn)行PASTV檢測，結(jié)果表明豬群PASTV2型感染率為11.5％（9/78）。

3 結(jié)論與討論

目前我國對豬星狀病毒的研究相對較少，湖南省內(nèi)豬星狀病毒報道還是首例，本研究建立的豬星狀病毒2型PCR檢測分型方法，操作簡單，特異性強(qiáng)，敏感性良好。能快速的檢測豬星狀病毒2型在豬群中的感染率，為PAstV流行病學(xué)調(diào)查研究提供了簡單、快速、準(zhǔn)確的檢測方法。

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S852.65+9.6

A

1006-4907（2016）02-0039-03

10.3969/j.issn.1006-4907.2016.02.019

2016-02-18

國家自然科學(xué)基金(31372459)。作者簡介：羅璋（1990～），男，在讀研究生，研究方向：病原分子生物學(xué)。

※通訊作者：肖朝庭，E-mai1：xiaocht@126.com。