聶 昂，王婕敏，張居作，蔡文杰，袁安文※，薛立群※

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南長沙410128；2.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南長沙410131）

PRV定量PCR檢測方法的建立及其在豬精液檢測中的初步應用

聶 昂1，王婕敏1，張居作1，蔡文杰2，袁安文1※，薛立群1※

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南長沙410128；2.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南長沙410131）

文章根據(jù)PRV基因序列，設計特異性引物擴增gH基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒；優(yōu)化實驗條件，建立PRV SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法。結(jié)果表明該方法的標準曲線線性關(guān)系良好，R 2=0.998，E=103.854％；特異性強，檢測豬細小病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)2型病毒、豬乙腦病毒和豬瘟兔化弱毒疫苗等均無擴增曲線；靈敏度高，最低可檢測到的27.9拷貝；在公豬精液中最低可檢測到病毒量為16TCID50/100μL，可重復驗證，變異系數(shù)均低于3.5％；利用該方法對湖南省109份公豬精液樣品進行了檢測，發(fā)現(xiàn)20份陽性樣品，陽性率為18.35％，比國標普通PCR法檢出率高。該方法的建立將為PRV的流行病學調(diào)查提供可靠的技術(shù)支持。

PRV；熒光定量PCR；公豬精液；流行病學

豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)又稱豬皰疹病毒Ⅰ型，是危害養(yǎng)豬業(yè)的主要病原之一，主要引起仔豬死亡，母豬繁殖障礙（早產(chǎn)，流產(chǎn)，死胎，木乃伊胎）；而成年豬多為潛伏感染[1]。豬偽狂犬病毒可以在豬群中水平傳播，也能夠通過公豬精液垂直傳播[2,3]。隨著人工授精技術(shù)在養(yǎng)豬業(yè)的推廣使用，病毒在豬群中的廣泛傳播的風險增加。為了掌握公豬精液中攜帶偽狂犬病毒的情況，有必要建立一種能夠在公豬精液中檢測出豬偽狂犬病毒的方法。熒光定量PCR技術(shù)是在普通PCR技術(shù)上發(fā)展起來的一種新的檢測技術(shù)。具有操作簡單快速、重復性好、特異性強、靈敏度高，可以準確定量檢測，能夠有效檢出早期感染和潛伏感染病毒的特點，現(xiàn)已在動物疫病檢測上廣泛應用[4]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和疫苗

豬偽狂犬病毒(PRV)分離株和豬細小病毒(PPV)分離株由湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院臨床分子實驗室保存；豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)毒株由湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院功能蛋白組學實驗中心饋贈，豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)，豬瘟病毒(CSFV)和豬乙型腦炎病毒(JEV)均為疫苗株。

1.1.2 主要試劑和儀器

1.1.3 公豬精液樣品

公豬精液樣品于2015年～2016年間采自湖南省內(nèi)15個豬場和人工授精站的公豬精液樣品共計109份，其中包括8個散養(yǎng)戶豬場的34份精液；5個規(guī)模化豬場的68份精液；2個人工授精站的7份精液。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計

比對GenBank中的多株P(guān)RV病毒gH基因序列，選取保守序列，參照PRV毒株（GenBank：NC_006151. 1）的gH基因，應用PrimerPremier5.0生物軟件設計了上游引物（PRV-F）和下游引物（PRV-R）由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.2.2 標準品的制備

運用PRV-F和PRV-R引物對提取的PRV DNA模板進行PCR擴增，反應程序為：94℃3min；94℃15s，62℃15s，72℃20s，35個循環(huán)；72℃10min。PCR產(chǎn)物1.5％瓊脂糖凝膠電泳,切膠回收純化目的基因片段，與pMD-18T載體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化進感受態(tài)細菌中，經(jīng)過藍白斑篩選，確定陽性菌落，大量培養(yǎng)，提取陽性重組質(zhì)粒。對陽性重組質(zhì)粒進行PCR驗證和Eco I和HindⅢ雙酶切驗證，對驗證正確的陽性重組質(zhì)粒進行測序鑒定。用Nanodrop2000核酸分析儀對測序正確的重組質(zhì)粒進行濃度測定，計算拷貝數(shù)。

1.2.3 PRV SYBRGreen I熒光定量PCR標準曲線的建立

將PRV重組質(zhì)粒標準品進行10倍倍比系列稀釋，選取各稀釋梯度重組質(zhì)粒作模板進行熒光定量PCR反應；其20μL體系為：SYBR Premix ExTaq (2×)20μL；PRV-F（20μM）和PRV-R（20μM）各0.2μL；ROX Reference Dye(50×)0.4μL；DNA模板2μL；ddH2O 7.2μL。反應程序為：95℃1min；95℃5s，62℃30s，共40個循環(huán)。溶解曲線反應程序為：95℃15s,60℃1min，95℃15s。進行數(shù)據(jù)分析，確定標準曲線。

1.2.4 PRVSYBRGreen I熒光定量PCR的特異性實驗

用PCV2、PRV、PPV的DNA，PRRSV、CSFV及JEV的cDNA作為模板，同時設立空白對照，每個樣品3個復孔，用建立的PRV SYBRGreen I熒光定量PCR方法進行檢測。用以檢測其特異性。

1.2.5 PRVSYBRGreen I熒光定量PCR的敏感性實驗

將已測濃度的PRV陽性重組質(zhì)粒進行10倍梯度系列稀釋，用所建立的熒光定量PCR方法進行檢測，得出所構(gòu)建方法的重組質(zhì)粒模板的最低檢出拷貝數(shù)。同時選取PRV病毒液（105.405TCID50/100μL）經(jīng)PBS 5倍梯度系列稀釋，將各稀釋度PRV病毒液混入陰性公豬精液中，提取DNA作模板，進行熒光定量PCR檢測，測定該方法在精液中的最低檢出病毒量。同時進行國標（GB/T 18641-2002）常規(guī)PCR[5]檢測，對比兩種方法的靈敏度。

1.2.6 PRVSYBRGreen I熒光定量PCR的重復性實驗

選取濃度為2.79×106copies/μL、2.79×105copies/μL、2.79×104copies/μL的陽性重組質(zhì)粒稀釋品和選取混入PRV病毒50819 TCID50/100μ L、407 TCID50/100μL、16 TCID50/100μL的精液樣品，用建立的PRV SYBRGreen I rea1-time PCR進行3次批內(nèi)重復試驗和3次批間重復試驗，實驗結(jié)束后對擴增曲線及Ct值進行分析。

1.2.7 臨床樣品檢測

對湖南省內(nèi)15個豬場和人工授精站采集的109份公豬精液樣品，應用構(gòu)建的PRV SYBRGreen Irea1-time PCR方法進行檢測，同時根據(jù)國家標準GB/T 18641-2002中的檢測方法[5]進行常規(guī)PCR檢測，對比檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 PRV陽性標準品的制備

運用設計的引物經(jīng)梯度PCR擴增和1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示，擴增出與預期大小相符的片段（146 bp），最佳退火溫度為62℃。構(gòu)建的PRV重組質(zhì)粒送華大測序，測序結(jié)果與參考序列進行比對，同源性為100％。用Nanodrop2000核酸分析儀測得PRV重組質(zhì)粒濃度為86.7ng/μL，計算得出拷貝數(shù)為2.79×1010copies/μL。

(M:DL2000DNAMarker;1:52℃;2:54℃;3:56℃;4:58℃;5:60℃;6:62℃)圖1 PRV目的基因PCR擴增結(jié)果

將制備的標準質(zhì)粒10倍倍比稀釋，選取2.79×1010copies/μL濃度的標準質(zhì)粒做模板，進行熒光定量PCR反應，根據(jù)結(jié)果系統(tǒng)繪制出標準曲線，結(jié)果顯示在2.79×106～2.79×101copies/μL濃度有良好的線性關(guān)系，得到的標準曲線較為理想(圖2)。標準曲線的相關(guān)系數(shù)為：R2：0.998；E=103. 854％。PRV的拷貝數(shù)與Ct值之間的線性關(guān)系表達式為：Ct=-3.233×1gDNA拷貝數(shù)+19.696。進行溶解曲線分析發(fā)現(xiàn)溶解峰單一，溶解溫度在88.8℃左右。

圖2 FQ-PRV熒光定量PCR標準曲線

圖3 FQ-PRV熒光定量特異性實驗結(jié)果

2.2.2 特異性實驗

特異性實驗結(jié)果（圖3）表明，PRV有特異性擴增，對照組PPV、PCV2、PRRSV、CSFV、JEV和陰性對照組均無特異性擴增。

2.2.3 敏感性實驗

構(gòu)建的PRV熒光定量PCR方法擴增2.79× 101copies/μL濃度重組質(zhì)粒模板和在公豬精液中檢測到16 TCID50/100μL仍然有S型曲線，低于該濃度不能檢測出，表明最低可以檢測到2.79×101拷貝數(shù)量級（圖4）和在公豬精液中最低可以檢測到16 TCID50/100μL（圖5）。國標普通PCR法[5]檢測結(jié)果顯示在81 TCID50/100μL時仍可見單一明顯條帶，低于該濃度后出現(xiàn)雜帶，結(jié)果不能準確判定，說明國標普通PCR法[5]最低可檢測到81 TCID50/100μL的病毒含量（圖6）。結(jié)果表明構(gòu)建的熒光定量PCR法的靈敏度比國標普通PCR法靈敏度高5倍。

(1～6：2.79×106copies/μL～2.79×101 copies/μL;7.陰性對照)圖4 FQ-PRV敏感性實驗結(jié)果

(1.50819TCID50/100μL;2.10164TCID50/100μL;3.2033TCID50/100μL; 4.407TCID50/100μL;5.81TCID50/100μL;6.16 TCID50/100μL;7.3.3 TCID50/100μL;8.陰性對照)圖5 FQ-PCR檢測公豬精液中PRV敏感性實驗結(jié)果

2.2.4 PRV重復性實驗

3次批內(nèi)重復實驗和3次批間重復實驗結(jié)果表明：在重組質(zhì)粒檢測中其批內(nèi)實驗變異系數(shù)為0.10％～0.77％，批間實驗變異系數(shù)為1.88％～2.48％；在帶毒精液中批內(nèi)實驗變異系數(shù)為0.17％～0.50％，批間實驗變異系數(shù)為0.50％～3.46％。表明該方法有較高的重復性，保證了檢測結(jié)果的穩(wěn)定性與可靠性。

(1.50819TCID50/100μL;2.10164TCID50/100μL;3.2033TCID50/100μL;4. 407 TCID50/100μL;5.81 TCID50/100μL;6.16 TCID50/100μL;7.3.3 TCID50/100μL;8.0.66 TCID50/100μL;+:陽性對照;-:陰性對照;M. DL2000DNAM arker)圖6 PCR檢測公豬精液中PRV敏感性實驗

表1 熒光定量PCR的重復性試驗

2.3 臨床樣品檢測結(jié)果

采集的109份臨床精液樣品進行熒光定量PCR和國標GB/T 18641-2002普通PCR法[5]檢測。結(jié)果表明，國標普通PCR檢測出15份陽性樣品，檢出率13.76％；構(gòu)建的PRV SYBR Green I rea1-time PCR方法檢出20份陽性樣品，陽性率18.35％。說明構(gòu)建的PRV熒光定量PCR方法比國標普通PCR法靈敏度高。

3 討論

gH基因是偽狂犬病毒復制的必須基因，較為保守[6]。本實驗對多株偽狂犬病毒毒株進行了同源性比較，選取gH基因的保守性序列，應用Primer Premier5.0生物軟件設計了1對特異性引物。構(gòu)建的SYBRGreen Irea1-time PCR方法標準曲線線性關(guān)系良好，R2=0.998，E=103.854％；特異性強，溶解曲線峰值單一，檢測豬細小病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)2型病毒、豬乙腦病毒和豬瘟兔化弱毒疫苗等均無擴增曲線；靈敏度高，最低可檢測到的27.9拷貝的陽性質(zhì)粒，在公豬精液中最低可檢測到的病毒量為16TCID50/100μL,靈敏度與楊紅杰等[7]和李雪明等[8]建立的PRV SYBRGreen I熒光定量PCR方法的檢測靈敏度（86拷貝/μL和69拷貝/μL）相當；重復性檢測結(jié)果良好，批內(nèi)和批間實驗的變異系數(shù)均低于3.5％。

PCR技術(shù)已被用于檢測精液中豬偽狂犬病毒。2006年4月～10月間孫泉云等對上海及其周邊地區(qū)30個豬場和人工授精站的355份精液進行了檢測，結(jié)果表明，PRV陽性率為2.54％，且存在PRV和PPV混合感染[9]；黃夏等應用PCR技術(shù)對廣西6市12個種豬場441份精液進行檢測發(fā)現(xiàn)，PRV精液樣品陽性率為0.45％[10]。2006年黃夏等應用PCR技術(shù)對廣西11個種豬場235份精液進行檢測，PRV陽性率為5.53％[11]，并且發(fā)現(xiàn)PRV和PPV、PCV2混合感染嚴重。2009年馮迎春等對四川各地區(qū)豬場76份精液進行了檢測，檢測結(jié)果表明PRV帶毒率較高為19.7％[12]。王軍一等對2007～2009年山東部分地區(qū)727份精液樣品進行5種主要病原檢測，結(jié)果顯示PRV陽性率為0.96％[13]。雷湘蘭等于2010年～2012年對海南省部分種豬的精液進行調(diào)查發(fā)現(xiàn)PRV感染率為4.80％[14]。本研究運用構(gòu)建的熒光定量PCR方法和國標普通PCR法[5]對109份精液樣品進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的熒光定量PCR方法檢出20份陽性樣品，陽性率18.35％。而國標普通PCR法檢出15份陽性樣品，陽性率為13.76％。結(jié)果表明構(gòu)建的熒光定量PCR檢出率比普通PCR要高，有利于種公豬精液中PRV在潛伏感染期和早期感染的檢出。

人工授精技術(shù)的廣泛應用為PRV通過種豬精液傳播提供了可能。因此，加強種公豬精液病原生物的監(jiān)測對于控制疫病的傳播有重要意義。本研究構(gòu)建的PRV SYBRGreen Irea1-time PCR方法具有穩(wěn)定性強、靈敏度高、特異性好等特點，為檢測種公豬精液中PRV感染情況提供了有效的檢測手段，有較高的應用價值。

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S852.65

A

1006-4907（2016）02-0031-05

10.3969/j.issn.1006-4907.2016.02.016

2016-03-01

聶昂（1991～），男，臨床獸醫(yī)碩士研究生。

※通訊作者：袁安文（1967～），男，教授，研究方向：動物生殖醫(yī)學，yuananweng@163.com。

※通訊作者：薛立群（1955～），男，教授，研究方向：動物生殖醫(yī)學，liqun_xue@aliyun.com。