俞鵬，朱珍珍，賈杏林

（1.湖南省常德市畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)局，湖南常德415400；湖南省常德津市市畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)局，湖南常德415400；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙410128）

IHA法和間接ELISA法檢測豬附紅細胞體抗體結(jié)果對比分析

俞鵬1，朱珍珍2，賈杏林3※

（1.湖南省常德市畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)局，湖南常德415400；湖南省常德津市市畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)局，湖南常德415400；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙410128）

為了尋求適用于基層實驗室對豬附紅細胞體抗體的檢測方法，文章試驗用間接血凝試驗（IHA）和間接ELISA兩種方法分別檢測了402份臨床送檢豬血清，并對這兩種方法的敏感性和符合率進行比較研究。結(jié)果表明，IHA和ELISA法結(jié)果符合率為80.1％，且ELISA方法比IHA敏感性更高，更適合批量檢測和群體普查。

豬附紅細胞體；抗體；間接ELISA;IHA；對比

豬附紅細胞體病在世界范圍內(nèi)對所有日齡豬均有危害，常與豬瘟、豬肺疫、豬鏈球菌病、豬流感等疾病混合感染，病愈后的豬可終生攜帶病原[1-2]。該病的流行不但對畜牧業(yè)造成重大經(jīng)濟損失，而且對人類健康構(gòu)成威脅，因此，急需一種對豬附紅細胞體病準(zhǔn)確、快速、簡便的檢測方法。

一直以來，由于尚無對附紅細胞體成熟的體外培養(yǎng)方法，難以獲取大量原始抗原，阻礙了血清學(xué)檢測附紅細胞體的發(fā)展以及快速診斷試劑盒的研制[3]。湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院李曉云博士[4]改進了豬附紅細胞體的培養(yǎng)體系，做到除首次接種外不添加任何紅細胞且連續(xù)培養(yǎng)達280d以上，染蟲率維持近100％。本實驗全菌病原均由李曉云老師提供，為實驗的順利完成提供了重要保障，同時也證明了附紅細胞體培養(yǎng)的可行性。

目前國內(nèi)對豬附紅細胞體病的檢疫常采用傳統(tǒng)的染色鏡檢法，該法敏感度較低。血清學(xué)方法最適合群體檢測，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和IHA是臨床上較常用的一種血清學(xué)檢測方法[5]。為了尋求適用于基層實驗室對豬附紅細胞體病抗體檢測方法，將血清學(xué)檢測方法廣泛的應(yīng)用于臨床診斷，本文將進一步探討兩種試驗方法的敏感性及特異性。

1 材料及方法

1.1 試驗材料

1.1.1 抗原

豬附紅細胞體抗原由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院李曉云博士等人提供。豬附紅細胞體用Thermo NANODROP 2000微量分光光度計A260/A280測定蛋白濃度。

1.1.2 豬血清

陰性血清由Gibco公司生產(chǎn)，且IHA檢測為陰性;陽性血清由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院臨床獸醫(yī)學(xué)實驗室自制;微量分光光度計（型號為Thermo NANODROP 2000）由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院臨床獸醫(yī)學(xué)實驗室提供；臨床檢測樣來自湖南省22個豬場。

1.2 方法

1.2.1 陽性血清的制備

將培養(yǎng)抗原依照楊漢春[6]等人的方法免疫家豬（母豬），每周一次，免疫4次。最后一次免疫9天后心臟采血分離血清,間接ELISA法檢測抗體效價。間接ELISA效價檢測的結(jié)果判定:以測定孔OD值(P)/陰性對照孔OD值(N)≥2.1判為陽性,1.5≤P/N≤2.1為可疑,P/N＜1.5為陰性。

1.2.2 間接ELISA

按照本實驗室建立的ELISA方法，抗原80ug每孔4℃包被過夜，洗滌3次；用0.5％BSA37℃封閉1小時加4℃封閉一小時，洗滌3次;血清1:40作用1.5小時后洗滌3次;辣根過氧化物酶兔抗豬IgG 1:1000稀釋作用為45min后洗滌5次;最后TMB 37℃顯色20min。ELISA結(jié)果判定如下，當(dāng)OD450≥0.228時判為陽性；當(dāng)OD450＜0.162時判為陰性；當(dāng)0.162≤OD450＜0.195時判為可疑。

1.2.3 間接血凝實驗(IHA)

在96孔微量板中每孔加入25μL稀釋液；將待檢血清25μL加入第1孔混勻后倍比稀釋至12孔，最后1孔棄去25μL。此時1排的1～12孔待測血清的稀釋度依次為：1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1: 64、1:128、1:256、1:512、1:1024、1:2048、1:4096。2號待檢血清加入第2排；取3號血清加入第3排,均按上方法稀釋；在微量板的第7排加陰性性血清25μL倍比稀釋到第4孔。第5～6孔為稀釋液對照。在第8排的第1孔加陽性血清25μL并倍比稀釋到第12孔掉。被檢血清各孔、陰性對照各孔、陽性對照各孔、稀釋液對照孔均加入致敏紅細胞25 μL。加樣完畢，于微型振蕩器上振蕩3～5min，并將血凝板放于有濕紗布的搪瓷盤內(nèi)，置37℃恒溫箱中40～60min,取出觀察結(jié)果，必要時放室溫下過夜，做終判。IHA試驗判定標(biāo)準(zhǔn)為小于或等于1:8判為陰性，大于1:8判為陽性。

1.2.4 敏感性試驗

分別用IHA和ELISA同時檢測8份豬陽性血清，比較兩種方法的敏感性。

1.2.5 臨床樣品檢測及符合率試驗

用IHA和ELISA方法分別檢測湖南22個豬場402份送檢血清，比較二者的靈敏度及符合率。

2 結(jié)果

2.1 敏感性試驗

取8份豬血清，倍比稀釋后分別用IHA和ELISA方法檢測。結(jié)果表明，ELISA方法的敏感性比IHA高5倍左右。

表1 I HA法和間接EL I SA法敏感性結(jié)果比較

2.2 符合率試驗

從表2可知，用IHA和ELISA方法同時檢測臨床送檢豬血清402份，IHA和ELISA的陽性率分別為53.73％、57.21％。

從表3可知，相對IHA法檢測，間接ELISA法檢測陽性（a）為187份，陰性(d)135份，假陽性（c）為29份。間接ELISA法檢測靈敏度=a/(a+c)×100％ =86.6％;特異度=d/(b+d)×100％=72.6％;漏檢率=c/ (a+c)×100％=13.4％;誤診率=b/(b+d)×100％=27. 4％;診斷符合率=（a+d）/(a+b+c+d)×100％=80.1％。

表2 兩種方法檢測豬附紅細胞體抗體結(jié)果

表3 間接血凝抑制法和間接E L I S A法符合率試驗結(jié)果

3 討論

ELISA與IHA方法比較結(jié)果可知，IHA和ELISA的陽性率分別為53.73％、57.21％，兩者總符合率為80.15。ELISA比IHA的敏感度更高，并且具有快速、靈敏、操作更加簡便等優(yōu)點，可最大限度的避免試驗過程中各種因素對結(jié)果的影響并減輕實驗室人員的工作強度。另外也可用于檢測單個樣本，特別適用于基層防疫員和規(guī)模戶，大大方便的畜病的快速診斷，有效提高了該病的檢出率。

參考文獻：

[1]王國永,潘耀謙,劉志軍.豬附紅細胞體檢測方法研究概況[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2006,27(5):9-12.

[2]Wu J,Yu J,Song C.Porcine eperythrozoonosis in China[J]. Vet.J,2012,193(2):535-8.

[3]張長瑩，李玉峰，華榮蓉.豬支原體重組MSGI蛋白間接ELISA檢測方法的建立[J].畜牧與獸醫(yī),2011,43(2):12-18.

[4]李曉云,賈杏林,石德時,等.豬附紅細胞體的體外連續(xù)培養(yǎng)[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2008,39(8):1142-1146.

[5]戴愛玲,李曉華,楊小燕.間接血凝試驗與酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測豬瘟抗體的比較[C].福建：福建省畜牧獸醫(yī)學(xué)會論文集.2009:122-126.

[6]楊漢春.動物免疫學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2003.

S854.43

A

1006-4907（2016）02-0035-02

10.3969/j.issn.1006-4907.2016.02.017

2016-02-19

※通訊作者：賈杏林。