肖兵南，高中文，李劍鋒，蔣小文

（1湖南民康生物技術(shù)研究所，湖南長沙410022；2.湖南省寧鄉(xiāng)縣畜產(chǎn)品檢測中心，湖南寧鄉(xiāng)410600）

兩種鼠血清與兩種培養(yǎng)基對PK15細(xì)胞培養(yǎng)的比較

肖兵南1，高中文1，李劍鋒2，蔣小文1

（1湖南民康生物技術(shù)研究所，湖南長沙410022；2.湖南省寧鄉(xiāng)縣畜產(chǎn)品檢測中心，湖南寧鄉(xiāng)410600）

為比較研究DMEM培養(yǎng)基和RPM I-1640培養(yǎng)基對PK15細(xì)胞的培養(yǎng)效果，選擇效果好的作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用大鼠血清和小鼠血清分別以不同量添加進(jìn)行培養(yǎng)，用細(xì)胞顯微病變（CPE）觀察法和四甲基偶氮唑鹽(MTT)測定法測定其對細(xì)胞生長的影響，為血藥試驗選擇試驗動物提供依據(jù)。結(jié)果表明：DMEM培養(yǎng)基較RPM I-1640培養(yǎng)基對PK15細(xì)胞的培養(yǎng)效果好，加5％大鼠血清或2.5％小鼠血清配制DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)，對PK15細(xì)胞的培養(yǎng)生長無副作用，即兩種血清的無毒安全濃度分別為5％和2.5％。

鼠血清；培養(yǎng)基；DMEM；RPM I-1640；PK15細(xì)胞；培養(yǎng)

用含藥血清進(jìn)行體外試驗時,經(jīng)常會遇到選擇何種試驗動物的問題，原則上首先要使體外培養(yǎng)細(xì)胞在該種動物血清中生長良好、形態(tài)正常,對照組血清質(zhì)量穩(wěn)定,并且血清添加量能夠比較高[1]。豬腎上皮細(xì)胞PK15，來源于豬腎，正常的細(xì)胞形態(tài)為上皮樣，貼壁生長。PK15細(xì)胞對多種病毒比較敏感，如豬圓環(huán)病毒（PCV）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬瘟病毒（CSFV）等，可應(yīng)用于豬圓環(huán)病毒疫苗、豬細(xì)小病毒疫苗、豬瘟病毒疫苗等的制備，在科研中被廣泛使用，其優(yōu)點是它的遺傳穩(wěn)定，營養(yǎng)要求較低，可使用多種培養(yǎng)基，易培養(yǎng)、易保存[2,3]。為此，本試驗選用無血清培養(yǎng)基DMEM和RPMI-1640對PK15細(xì)胞作比較培養(yǎng)試驗，篩選出效果好的作基礎(chǔ)培養(yǎng)基，再添加大鼠和小鼠兩種常用試驗動物的血清，配制不同濃度的鼠血清培養(yǎng)基對PK15進(jìn)行培養(yǎng)試驗，測定其對PK15細(xì)胞生長的影響，為血藥試驗選擇試驗動物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

豬傳代腎細(xì)胞PK15（湖南農(nóng)大動醫(yī)院提供）；0.25％胰蛋白酶、RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、犢牛血清均為GIBCO公司生產(chǎn)；青霉素-鏈霉素，兩性霉素，PBS緩沖液，均為細(xì)胞培養(yǎng)用。

1.2 主要試驗儀器

10L-CO2培養(yǎng)箱（長沙市長錦科技有限公司）；倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；純水儀（艾柯試驗設(shè)備有限公司）；低速離心機（XYJ-801型，江蘇醫(yī)療儀器廠）；塑料培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、凍存管（美國COSTAR公司產(chǎn)品）；25mm濾器和0.22μm的微孔濾膜（上海興亞醫(yī)用凈化器材廠）。

1.3 試驗試劑配制方法

1.3.1 細(xì)胞生長液（培養(yǎng)液）：在DMEM/RPMI-1640培養(yǎng)液中加入10％的小牛血清和1mL雙抗，4℃保存；

1.3.2 細(xì)胞維持液（營養(yǎng)液）：在DMEM/RPMI-1640培養(yǎng)液中加入2％的小牛血清，4℃保存；

1.3.3 大鼠血清和小鼠血清：由湖南斯萊克景達(dá)試驗動物有限公司提供，56℃滅活30min，0.22μm微孔濾膜過濾滅菌分裝-20℃保存；

1.4 兩種培養(yǎng)基對PK15細(xì)胞培養(yǎng)的比較[4]

1.4.1 細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)：取細(xì)胞凍存管置37℃水浴搖動解凍，用移液槍吸入2個培養(yǎng)瓶中，加入適量DMEM細(xì)胞生長液，于37℃、5％CO2培養(yǎng)；4 h后細(xì)胞貼壁，換新的培養(yǎng)液至單層細(xì)胞形成。

1.4.2 接種與培養(yǎng)：復(fù)蘇細(xì)胞長成單層時，及時取出，在無菌條件下小心吸出舊培養(yǎng)液，用37℃預(yù)熱的PBS清洗（沖洗）后，加入適量預(yù)熱的胰蛋白酶消化液1mL消化3～5min，倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，90％細(xì)胞脫落，為消化適度。然后離心棄去胰蛋白酶液，加入DMEM細(xì)胞營養(yǎng)液10mL，用吸管輕輕吹打數(shù)十次，打散細(xì)胞，取少量均勻細(xì)胞懸液鏡下觀察，用白細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。將細(xì)胞懸液平均分為2份，分別離心，再加入不同的培養(yǎng)液，混合均勻后接種6孔板上，每孔加入懸液1mL（細(xì)胞數(shù)量為6.2×104）。將細(xì)胞板置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。1.4.3試驗分組：試驗I組：RPMI-1640培養(yǎng)液；試驗Ⅱ組：DMEM培養(yǎng)液；每組設(shè)6個重復(fù)。

1.4.4 細(xì)胞觀察計數(shù)：觀察細(xì)胞生長情形，并分別于培養(yǎng)后10 h、15 h、20 h、25 h、30 h用胰酶消化5～7 min，加入1mL營養(yǎng)液，快速吹打分散，用白細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)。

1.5 兩種鼠血清對PK15細(xì)胞生存影響的測定

1.5.1 血清處理：取滅活大鼠血清和小鼠血清，用維持液倍比稀釋稀釋成不同的濃度:80％、40％、20％、10％、5％、2.5％、1.25％、0.625％，置37℃預(yù)熱備用。

1.5.2 鼠血清對PK15細(xì)胞的培養(yǎng)：按1.4方法用96孔板以DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)PK15細(xì)胞約24 h至單層貼壁后，棄去上清液；從高濃度到低濃度分別加入含不同稀釋度鼠血清的DMEM培養(yǎng)液，每孔100 μL，每個濃度重復(fù)8孔，設(shè)10％犢牛血清培養(yǎng)液作對照，37℃,5％CO2培養(yǎng)48 h。

1.5.3 鼠血清對細(xì)胞生存影響的測定

（1）細(xì)胞毒性作用的測定：對含鼠血清培養(yǎng)細(xì)胞，定時于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變率（CPE）并記錄結(jié)果，以最后的記錄結(jié)果為最終結(jié)果。

（2）細(xì)胞增殖作用的測定：細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，棄去上清液，用預(yù)熱至37℃的PBS溶液漂洗2次；每孔加入10μL的MTT（5mg/mL溶于PBS），37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入DMSO 100μL，在微量振蕩器上振蕩10min，以溶解細(xì)胞中的紫色結(jié)晶物；然后在酶標(biāo)儀570 nm處測定光吸收值，計算活細(xì)胞率：活細(xì)胞率（％）=（加鼠血清孔OD值/犢牛血清對照孔OD值）×100％

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

用Exce1和Spss11.5對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，各組數(shù)據(jù)均以x±SD表示，并用Spss11.5軟件的ANOVA進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種培養(yǎng)液對PK15細(xì)胞生長的影響

培養(yǎng)結(jié)果顯示：DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)明顯優(yōu)于RPMI-1640培養(yǎng)液，細(xì)胞密度大，生長快，長勢好。統(tǒng)計分析計算二者差異顯著（P＜0.05）,結(jié)果見表1。

表1 不同培養(yǎng)基對p k-1 5生長的影響(×1 0 4)(x±s,n=6)

2.2 兩種鼠血清對PK15細(xì)胞生存的影響

2.2.1 細(xì)胞病變率（CPE）測定：PK15細(xì)胞用含不同濃度大鼠血清和小鼠血清的DMEM培養(yǎng)液分別進(jìn)行培養(yǎng)(48h)，鏡檢顯示：大鼠血清和小鼠血清對PK15細(xì)胞均呈現(xiàn)一定的毒副作用，高濃度時導(dǎo)致細(xì)胞病變:細(xì)胞圓縮、堆積、脫落。這種病變隨著血清濃度的降低而下降，至含2.5％小鼠血清和5％大鼠血清時無CPE出現(xiàn)（見表2），由表2可見，2.5％小鼠血清和5％大鼠血清為最大的無毒濃度。

表2 不同濃度鼠血清導(dǎo)致的CPE情況（4 8 h）

2.2.2 細(xì)胞生長存活率測定：用MTT法測定OD值，計算細(xì)胞生長存活率（與犢牛血清比較），結(jié)果見表3：高濃度時大鼠血清對PK15細(xì)胞的副作用較小鼠血清小，同濃度血清活細(xì)胞多；低濃度時，大鼠血清5％及其以下保持細(xì)胞生長增殖，小鼠血清2.5％及其以下保持細(xì)胞生長增殖。

表3 不同濃度鼠血清作用P K 1 5細(xì)胞的生存率

3 結(jié)論與討論

3.1 DMEM和RPMI-1640培養(yǎng)液對PK15細(xì)胞的比較培養(yǎng)，從細(xì)胞生長速度、細(xì)胞密度等生長情況顯示，DMEM培養(yǎng)液比RPMI-1640培養(yǎng)液更適合PK15細(xì)胞的生長，與付世新2004年的報道[5]相似。

3.2 小鼠和大鼠血清對PK15細(xì)胞的最大無毒分別為2.5％和5％。這一結(jié)果與趙秀梅等報道的用異種動物血清對培養(yǎng)人腫瘤細(xì)胞生長的影響[6]結(jié)果相似。

3.3 吳健宇等用MTT法檢測不同種屬的動物血清和人血清對3T3細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示不同種屬動物血清對細(xì)胞的毒性作用與其種屬親源有關(guān)[7]。所以，在選擇含藥血清的供體動物時，應(yīng)盡量選擇與培養(yǎng)細(xì)胞親緣關(guān)系較近者。本試驗在某種意義上支持這一結(jié)論。

[1]汪鴻宇,俞仲毅,符勝光,等.血清藥理實驗中不同動物種屬血清對脾臟淋巴細(xì)胞的影響[J].中國中醫(yī)藥科技,2001,(3): 185-186.

[2]陳丹英,高云飛,李麗霞,等.PK15細(xì)胞凋亡過程中角蛋白中間纖維的變化[J].動物學(xué)報，2002，48(1)：58-63.

[3]董關(guān)木,鄭海發(fā),劉發(fā)順,等.精致Vero細(xì)胞狂犬病疫苗的臨床觀察及免疫學(xué)效果的研究[J].中華試驗和臨床病毒學(xué)雜志,2000,14（1）:356-359.

[4]于麗華，崔洪新.不同種類血清對新生大鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的影響[J].實用醫(yī)藥雜志,2002,(3):

[5]付世新，李曉龍，王長遠(yuǎn)，等.不同培養(yǎng)基對PK15細(xì)胞增殖影響的研究[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，2004,(1):62-64.

[6]趙秀梅，馮文茹，胡人杰.異種動物血清對體外培養(yǎng)人腫瘤細(xì)胞生長的影響[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2010,(6):190-192.

[7]吳健宇，穆靜，李儀奎.血清藥理試驗中異種動物血清對細(xì)胞的毒性作用和滅活后的減毒作用[J].中國藥理學(xué)通報，2000,16(1):118-119.

Q253

A

1006-4907（2016）02-0044-03

10.3969/j.issn.1006-4907.2016.02.021

2015-12-23