張賢梅 江 波 孫勤國

武漢市第三醫(yī)院中醫(yī)科，武漢 430060

·文獻(xiàn)綜述·

糖尿病實(shí)驗(yàn)動物模型的研究進(jìn)展*

張賢梅 江 波 孫勤國△

武漢市第三醫(yī)院中醫(yī)科，武漢 430060

據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會2015年發(fā)布《糖尿病地圖》：目前，全球估計(jì)有4.15億糖尿病患者，其中75%的糖尿病人群生活在中低收入國家，每6秒就有1人因糖尿病死亡，糖尿病消耗全球12%醫(yī)療費(fèi)用，推測到2040年，全球糖尿病患病人數(shù)將達(dá)到42億，其相關(guān)費(fèi)用將突破8 020億美元，中國患病人數(shù)將達(dá)1.1億[1-2]。面對如此嚴(yán)峻的形式，必須做好糖尿病的三級預(yù)防，大家在探究最佳管理模式、最佳用藥方案的同時(shí)，發(fā)病機(jī)制及新藥的研究將是未來研究的主要方向之一，不論是發(fā)病機(jī)制探討還是新藥的開發(fā)都離不開實(shí)驗(yàn)動物模型的建立，目前國內(nèi)外尚無統(tǒng)一的糖尿病模型建立標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)過程中多根據(jù)糖尿病臨床表現(xiàn)、胰島素依賴性、遺傳特性等來建立糖尿病的近似實(shí)驗(yàn)動物模型?，F(xiàn)就近幾年相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道對建立糖尿病動物模型的常用相關(guān)要點(diǎn)進(jìn)行綜述，期望在此有所參考。

1 實(shí)驗(yàn)動物的選擇

1.1 自發(fā)性模型動物

自發(fā)性糖尿病模型動物是指由于先天性或遺傳因素在自然條件下可發(fā)生糖尿病的動物，其發(fā)生、發(fā)展近似人類糖尿病病理改變過程。這些動物包括小鼠、大鼠、地鼠、非人靈長類動物、新西蘭白兔、犬等，其中小鼠包括KK-Ay、ob/ob、db/db等單基因突變鼠、新西蘭肥胖(New Zealand obese，NZO)小鼠、NSY(Nagoya-Shibata-Yasuda)小鼠等；大鼠包括GK(Goto Kakizaki)大鼠、Zucker(fa/fa)大鼠和OLETF(Otsuka Long-Evans Tokushima fatty)大鼠等；地鼠以中國地鼠(Chinese hamster)為主，非人靈長類動物有獼猴、食蟹猴和樹鼩等。常用類似人類1型糖尿病模型動物包括非肥胖糖尿病(non-obese diabetic，NOD)小鼠、BB(bio breeding)大鼠、LETL(Long-Evans Tokushima lean)大鼠、新西蘭白兔(New Zealand white rabbit)、荷蘭毛獅犬(Keeshond dog)、中國倉鼠(Chinese hamster)等，其中以NOD小鼠、BB大鼠最多。ob/ob、db/db、Zucker、GK、KK-Ay等動物因具有高血糖、高胰島素血癥、高三酰甘油血癥、胰島素抵抗等類似人類2型糖尿病過程的主要特征[3]常被用于2型糖尿病模型動物。自發(fā)性的非人靈長類動物糖尿病病癥非常類似人類2型糖尿病，但因其非常難得，很難廣泛應(yīng)用。這類動物因價(jià)格昂貴，飼養(yǎng)要求高，個體差異大在國內(nèi)較少應(yīng)用。

1.2 轉(zhuǎn)基因模型動物

轉(zhuǎn)基因動物主要是指用實(shí)驗(yàn)方法敲除內(nèi)源基因或轉(zhuǎn)入外源基因，在染色體組內(nèi)穩(wěn)定整合并能遺傳給后代的一類動物，這些敲除或者突變的基因會導(dǎo)致胰島素受體的敏感性下降及胰島素抵抗的發(fā)生。MKR小鼠因骨骼肌特異性胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)功能的缺失在出生5周后表現(xiàn)為明顯胰島素抵抗、胰島β細(xì)胞功能紊亂及脂代謝紊亂等，且其存活率高，是一種研究2型糖尿病的極好模型動物；GK/IRS-1為雙基因剔除小鼠，表現(xiàn)2型糖尿病癥狀，既有胰島素抵抗又有糖耐量異常；青幼年發(fā)病的成年型糖尿病(maturity-onset diabetes of the young，MODY)是2型糖尿病的一個亞型，有5種蛋白質(zhì)的基因缺失或突變；MC4R(melanocortin 4 receptor)通過敲除MC4R基因建立的動物模型，可以用來研究具有肥胖、高胰島素、高瘦素、貪食等特征的2型糖尿病[4-5]。這類動物因技術(shù)水平要求高，操作復(fù)雜，精密儀器配備齊全，價(jià)格非常昂貴，目前國內(nèi)尚處于摸索階段。

1.3 誘發(fā)性模型動物

誘發(fā)方法包括手術(shù)誘導(dǎo)、化學(xué)藥物誘導(dǎo)和飲食誘導(dǎo)。手術(shù)誘導(dǎo)是切除全部或部分胰腺，造成糖尿病模型，狗、豬、兔和大鼠切除70%或90%胰腺能夠造成糖尿病模型?；瘜W(xué)藥物誘導(dǎo)是通過鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)、四氧嘧啶(alloxan，ALX)等藥物注射至模型動物，破壞動物的胰島功能而產(chǎn)生高血糖、胰島素抵抗等，這些動物包括SD、Wistar大鼠，C57BL/6J小鼠、KM小鼠、長爪沙鼠、新西蘭兔、恒河猴、Beagle犬、樹鼩、云南省版納微型豬等。至于這些種屬區(qū)別，比較研究報(bào)道不多：35 mg/kg STZ一次性腹腔注射法顯示W(wǎng)istar大鼠造模結(jié)果優(yōu)于SD大鼠[3]；70 mg/kg一次性尾靜脈注射法顯示ICR小鼠在成模率及血糖值方面均優(yōu)于KM、NIH小鼠[6]；同等條件下STZ對C57比KM小鼠作用要緩慢[7]；C57BL/J6小鼠造模成功率較KM、ICR和BALB/c小鼠高[8]。特殊膳食誘導(dǎo)主要是給實(shí)驗(yàn)動物過量的食物或高蛋白、高脂、高糖飲食，使動物胰島β細(xì)胞負(fù)荷過重發(fā)生萎縮而引發(fā)糖尿病，沙鼠、土古鼠和小非洲刺毛鼠是重要的膳食誘導(dǎo)的肥胖模型和2型糖尿病模型[9]。這類動物因價(jià)格相對便宜，耗時(shí)短，易于操作，現(xiàn)為國內(nèi)較普遍的模型動物選擇。手術(shù)誘導(dǎo)因手術(shù)操作復(fù)雜、耗時(shí)長、切除后胰島的再生難以控制等，現(xiàn)已很少應(yīng)用，目前國內(nèi)外最常用的誘發(fā)方法為化學(xué)藥物聯(lián)合飲食誘導(dǎo)。

1.4 動物性別、體重的選擇

夏旋等[10]認(rèn)為雄鼠對STZ更敏感，發(fā)現(xiàn)8周齡雄大鼠成模率最高，小鼠性別對STZ敏感性依次為：雄小鼠>去勢雄小鼠=去勢雌小鼠>雌小鼠。李莉等[11]通過對SD大鼠腹腔注射STZ也得出雄鼠造模優(yōu)于雌鼠的結(jié)論，分析認(rèn)為這與性激素有關(guān)。葉華虎等[12]研究認(rèn)為雌性動物較雄性動物對ALX更敏感，在使用ALX復(fù)制糖尿病模型時(shí)，雄性動物較雌性動物所需劑量通常要高20%左右。王曉琳等[13]則認(rèn)為雄鼠對STZ的敏感性高于雌鼠，同時(shí)還得出不同性別大鼠可能建立不同類型糖尿病模型的結(jié)論，Wistar大鼠通過高脂飼料加腹腔注射25 mg/kg STZ造模，雌性大鼠可建立2型糖尿病模型，雄性大鼠則更類似1型糖尿病模型，明確提出低劑量STZ加膳食誘導(dǎo)方法要準(zhǔn)確制備出2型糖尿病模型，必須選擇雌性大鼠。奚清麗等[14]通過優(yōu)化組合認(rèn)為體重27～29 g的雄性小鼠腹腔注射ALX后成模率較高、死亡率較低，是血糖持續(xù)較穩(wěn)定的糖尿病小鼠模型。劉鷗飛等[15]研究認(rèn)為體重在151～200 g的大鼠對ALX的敏感性最高，造模成功率最大，死亡率最低。

2 實(shí)驗(yàn)動物的飲食

多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道高脂飲食更能模擬糖尿病模型特點(diǎn)，認(rèn)為高脂食物調(diào)控FOXA2和HNFlA兩個關(guān)鍵蛋白，擾亂胰島素分泌β細(xì)胞和監(jiān)控血糖濃度的能力，通過高脂飲食造成外周組織對胰島素不敏感，還有高血脂，再加小劑量化學(xué)誘導(dǎo)劑導(dǎo)致胰島的病理改變，造成胰島損傷，最終導(dǎo)致高血糖癥的發(fā)生。其配方是在普通飼料基礎(chǔ)上加一定比例的豬油、蔗糖、膽固醇、蛋黃粉、膽酸鹽、奶粉等。喂養(yǎng)時(shí)間一般是4～12周，因種屬差別、飼料配方比例不同而有差異，最長有云南省版納微型豬喂養(yǎng)達(dá)12個月之久。朱超等[3]認(rèn)為高脂高糖飼養(yǎng)時(shí)間長短與STZ劑量大小關(guān)系很大，考慮到動物的年齡及造模后續(xù)的實(shí)驗(yàn)時(shí)間，建議高脂高糖飼養(yǎng)時(shí)間4周左右為宜。王保偉等[16]給予大鼠高脂飼料喂養(yǎng)4周后腹腔注射STZ 30 mg/kg，成模率高達(dá)85%，喂養(yǎng)8周后腹腔注射相同體質(zhì)量STZ，死亡率達(dá)65%，10周后體重增長速度明顯降低。蔡爽等[17]則認(rèn)為高脂高糖飲食飼養(yǎng)6周后小劑量STZ注射效果最好。孫麗華等[18]研究強(qiáng)調(diào)單純注射STZ或高脂高糖飲食不能復(fù)制理想的糖尿病模型，二者對血糖異常具有相互促進(jìn)作用，同樣認(rèn)為高糖高脂膳食6周后血糖升高顯著，血清胰島素水平降低。

3 誘導(dǎo)劑的應(yīng)用

3.1 誘導(dǎo)劑的選擇及優(yōu)化

目前常用誘導(dǎo)劑有STZ和ALX，亦有較少文獻(xiàn)報(bào)道金硫葡萄糖(gold thioglucose，GTG)、D-半乳糖、谷氨酸鈉、地塞米松、氫化可的松等。STZ致糖尿病的基本機(jī)制可能在于β細(xì)胞通過胞膜葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體2(GLUT-2)攝取STZ，STZ可能通過氧化氨和(或)甲基化損傷DNA，NO可以誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡，DNA損傷使得多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)過度激活而使β細(xì)胞因能量衰竭而死亡和伴發(fā)糖尿病神經(jīng)、心肌并發(fā)癥，STZ更可能通過抑制氮乙酰葡萄糖胺糖苷酶(OGN)使得乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)堆積，影響胰島素的釋放[8]。聯(lián)合煙酰胺或抑制醛糖還原酶效果更好，劉斌等[19]應(yīng)用STZ聯(lián)合煙酰胺(腹腔注射煙酰胺60 mg/kg，15 min后腹腔注射STZ 65 mg/kg)誘導(dǎo)糖尿病Wistar大鼠成功率比單獨(dú)誘導(dǎo)組(腹腔注射與煙酰胺等量的生理鹽水，15 min后腹腔注射65 mg/kgSTZ)高，死亡率低，認(rèn)為煙酰胺可以保護(hù)胰島功能，使胰島素功能部分保留，使動物最大程度的產(chǎn)生中等的、穩(wěn)定的高血糖癥。梁佳欣[20]認(rèn)為抑制醛糖還原酶對小劑量多次注射STZ誘導(dǎo)的l型糖尿病小鼠模型有顯著保護(hù)作用。ALX導(dǎo)致糖尿病機(jī)制認(rèn)為是其游離氧基能氧化β細(xì)胞的DNA單鏈，使染色體發(fā)生異常，引起細(xì)胞畸變，并能抑制β細(xì)胞的多種代謝，增強(qiáng)其細(xì)胞膜的通透性而破壞β細(xì)胞。有研究[21]認(rèn)為以STZ聯(lián)合ALX(40 mg/kg×4 d+100 mg/kg×1 d)可提高造模成功率，單獨(dú)使用ALX(220 mg/kg)造模成功率較低，單獨(dú)使用STZ(40 mg/kg×4 d)造模成功率居中，而總膽固醇偏高。綜合比較，STZ造模優(yōu)于ALX，STZ半衰期較長(15 min)，具有造模穩(wěn)定、快速、種屬選擇性不強(qiáng)(豚鼠只能用STZ造模)、組織毒性相對較小、致死率較低等優(yōu)點(diǎn)，但其價(jià)格較ALX貴[7]。二者緩沖液均用PH 4.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液作溶媒，較生理鹽水作溶媒的成模率明顯增高，要求現(xiàn)配，避光，冰浴保存[22]。

3.2 誘導(dǎo)劑的干預(yù)方式及時(shí)間

誘導(dǎo)劑的干預(yù)方式有腹腔注射和靜脈注射2種，其中靜脈注射包括耳緣靜脈(兔)、尾靜脈(鼠)、下肢淺靜脈(犬)。一般認(rèn)為靜脈給藥效果優(yōu)于腹腔給藥，何學(xué)令等[23]以3%ALX靜脈給藥較腹腔給藥表現(xiàn)出明顯的“三多一少”癥狀，ALX的血漿半衰期僅1～2 min，故注射越快成模率越高。注射STZ時(shí)，鹽水導(dǎo)入(即尾靜脈給藥前先導(dǎo)入鹽水再推STZ溶液)可以大幅度降低STZ尾靜脈注射造模時(shí)的死亡率(6.52%)，提高成模率(73.9%)。干預(yù)時(shí)間，一般認(rèn)為空腹給藥效果好，空腹給藥可以增加胰島細(xì)胞對誘導(dǎo)劑的敏感性，用較低的藥物劑量就可以破壞胰島功能。一般禁食時(shí)間10～16 h為宜[24-27]。

3.3 誘導(dǎo)劑的給予頻次

綜合文獻(xiàn)分析，不管是ALX還是STZ，小劑量多次注射和大劑量單次注射均能獲得糖尿病模型，但單次大劑量注射造成的生理變化和血糖波動比小劑量多次注射更為劇烈[28]。韋立順等[29]用1%STZ溶液按照150 mg/kg一次性腹腔注射35～40 g雄性昆明種小鼠，造模成功率83.3%，血糖在1～8周內(nèi)均維持在較高水平，且胰腺和腎臟出現(xiàn)組織形態(tài)變化。70 mg/kg×5 d STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型成功率高，死亡率低，且很穩(wěn)定，至少可以維持12周[30]。孟建波等[31]用5%ALX給新西蘭兔連續(xù)2次小劑量(第1次按80 mg/kg，24 h后按120 mg/kg)經(jīng)耳緣靜脈快速注射給藥，其效果優(yōu)于一次性(150 mg/kg)高劑量給藥。此外，有報(bào)道[32]采用大劑量一次性注射的給藥方法，建立的大鼠模型與人類l型糖尿病相似，采用小劑量分次給藥的方法，建立的大鼠模型與人類2型糖尿病相似。

3.4 誘導(dǎo)劑的給予劑量

至于劑量則因種屬差異、飲食搭配、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、模型判定標(biāo)準(zhǔn)不同而不同。成雪等[33]研究認(rèn)為50 mg/kgALX為制備Beagle犬糖尿病模型的一次性腹腔注射的最佳劑量。在高脂飼料喂養(yǎng)4周基礎(chǔ)上，125 mg/kgSTZ一次性腹腔注射雌性KM小鼠造模效果最佳[34]。45 mg/kg是短期高糖高脂飲食聯(lián)合STZ腹腔注射建立2型糖尿病Wistar大鼠模型的最佳注射劑量[35]。50 mg/kg的STZ注射雄性恒河猴，雖成模率不如70 mg/kg，但可使該動物模型疾病病程延長，其維持高血糖狀態(tài)達(dá)1年余[36]。在高糖高脂飼料喂養(yǎng)5周后，25 mg/kg×2 d STZ腹腔注射SD大鼠，可建立大鼠2型糖尿病模型[37]。樊志奇等[38]研究認(rèn)為50 mg/kg×3 d尾靜脈注射1%ALX是18～22 g小鼠最佳制備小鼠糖尿病模型的方法。高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周后，認(rèn)為70 mg/kg的STZ為KM鼠和C57鼠最佳腹腔注射劑量[5]。

4 成模標(biāo)準(zhǔn)的判定

目前，國內(nèi)外對糖尿病模型成功標(biāo)準(zhǔn)尚無統(tǒng)一規(guī)定，多數(shù)除了觀察實(shí)驗(yàn)動物“三多一少”癥狀外，根據(jù)文獻(xiàn)或設(shè)置空白對照組進(jìn)行比較，有用空腹血糖≥6.1 mmol/L，和(或)隨機(jī)血糖或OGTT 2 h≥11.1 mmol/L，以隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L居多，且持續(xù)4～12周，作為模型成功的標(biāo)準(zhǔn)，單純研究模型還可測定血清胰島素、血脂、尿糖或鏡下觀察模型動物胰腺組織形態(tài)學(xué)變化，與空白組對照來判定模型成功與否。具體則因?qū)嶒?yàn)動物的飲食、禁食時(shí)間、動物種屬等的差異而有所不同。韋立順等[29]以小鼠禁食12 h尾尖取血測血糖≥16.7 mmol/L，并鏡下觀察胰腺及腎臟組織形態(tài)學(xué)變化為標(biāo)準(zhǔn)探索實(shí)驗(yàn)性糖尿病模型的建立方法。王嘉惠等[39]在高脂飲食聯(lián)合STZ誘導(dǎo)SD大鼠，以空腹血糖≥7.0 mmol/L作為模型成功標(biāo)準(zhǔn)，并以O(shè)GTT、胰島素敏感指數(shù)等評價(jià)模型穩(wěn)定性和有效性。

5 展望

糖尿病實(shí)驗(yàn)動物模型的建立是研究糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)病機(jī)制、藥學(xué)代謝及作用機(jī)制等的基礎(chǔ)，也是實(shí)驗(yàn)研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。根據(jù)目前研究報(bào)道，多數(shù)選擇小劑量多次腹腔注射STZ誘導(dǎo)高脂飲食4～6周的SD、Wistar大鼠及C57BL/6J、KM小鼠的造模方式。在具體研究過程中，常有實(shí)驗(yàn)動物種屬、誘導(dǎo)方法、實(shí)驗(yàn)條件以及技術(shù)等的差別和限制，無法確定同一種屬在特定條件下使用誘導(dǎo)劑的量、方式、時(shí)間以及最終成模情況。在此，有望在糖尿病模型研究方面有統(tǒng)一的參考方法和判定標(biāo)準(zhǔn)，為糖尿病及其并發(fā)癥相關(guān)方面的研究奠定更穩(wěn)固的基石。

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10.3969/j.issn.1674-4616.2017.02.018

*湖北省武漢市衛(wèi)計(jì)委科研項(xiàng)目(No.WZ14A02)

2017-01-21)

△通信作者，Corresponding author，E-mail：sunqg0919@qq.com