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腫瘤如何掩藏疼痛：PD-L1/PD-1通過下調(diào)傷害性神經(jīng)元活動抑制急慢性疼痛

程序性細胞死亡配體-1（PD-L1）通常由癌細胞產(chǎn)生，其通過表達在T細胞上的受體PD-1抑制免疫功能。然而，PD-L1和PD-1是否能調(diào)節(jié)疼痛和神經(jīng)元功能并不清楚。本研究顯示黑色素瘤和正常神經(jīng)組織（包括背根神經(jīng)節(jié)，DRG）都能產(chǎn)生PD-L1。在正常小鼠足底注射PD-L1后，通過PD-1產(chǎn)生了鎮(zhèn)痛效應；而PD-L1中和抗體或其阻斷劑能誘導小鼠產(chǎn)生機械性觸誘發(fā)痛。Pd1基因敲除的小鼠表現(xiàn)出熱和機械性痛覺過敏。機制上，DRG傷害性神經(jīng)元中的PD-1被PD-L1激活后誘導酪氨酸磷酸酶 (SHP-1) 磷酸化、抑制鈉通道、并激活TREK2鉀通道從而使神經(jīng)元超極化。PD-L1也能抑制人類DRG傷害性神經(jīng)元的興奮性。而且，黑色素瘤能產(chǎn)生大量的PD-L1，阻斷PD-L1或PD-1能使黑色素瘤小鼠產(chǎn)生自發(fā)性疼痛和觸誘發(fā)痛。本研究揭示了PD-L1作為內(nèi)源性疼痛抑制劑和神經(jīng)調(diào)質這一新功能。

研究背景

癌痛極大地損害了病人的生活質量。乳腺癌、肺癌和前列腺癌通常會轉移至骨，并通過釋放致痛性物質導致骨癌痛。這些物質包括質子、緩激肽、內(nèi)皮素、前列腺素、蛋白酶、生長因子等，如：神經(jīng)生長因子(NGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，它們與外周神經(jīng)相互作用導致傷害性神經(jīng)元（傷害性感受器）敏感性和興奮性增加。NGF和VEGF還能誘導癌癥部位疼痛傳導神經(jīng)纖維過度生長。盡管腫瘤產(chǎn)生的促疼痛介質一直備受關注，但腫瘤在轉移至骨之前，病人通常不會感到疼痛，如黑色素瘤病人在腫瘤轉移之前的疼痛就不常見。因此，不同的癌癥，甚至相同的癌癥在不同的生長階段可能會產(chǎn)生不同的疼痛相關介質，這些介質能正向或負向調(diào)節(jié)疼痛敏感性。

很多研究顯示，腫瘤（如黑色素瘤）能表達檢查點抑制蛋白PD-L1 (CD274)，并通過受體PD-1抑制T細胞功能和誘導免疫耐受。最新抗PD-1和抗PD-L1的免疫治療在癌癥（黑色素瘤、淋巴瘤、肺癌、卵巢癌等）治療方面取得了成功。但PD-L1/PD-1通路是否或怎樣通過非免疫途徑（如對神經(jīng)元的調(diào)節(jié)）調(diào)節(jié)疼痛敏感性還不清楚。初級傷害性感受器和免疫細胞具有某些相似性，都能與免疫細胞相互交流。一方面，傷害性感受器對細胞因子、趨化因子等免疫介質和細菌感染產(chǎn)生反應；另一方面還能表達細胞因子、趨化因子和Toll樣受體(TLRs)等主要的免疫調(diào)節(jié)劑。初級感覺神經(jīng)元上的TLRs能通過與離子通道相互作用快速地調(diào)節(jié)疼痛敏感性。在小鼠和人的傷害性神經(jīng)元是否表達功能性PD-1這一重要的免疫調(diào)節(jié)劑還不清楚。本文對此進行了研究。研究結果闡明了DRG中PD-L1/PD-1抑制疼痛的機制，同時也揭示了黑色素瘤通過表達PD-L1掩蓋疼痛的產(chǎn)生。

主要研究結果

1.PD-L1抑制急性炎癥性疼痛并提高正常動物的疼痛閾值

足底注射5%的福爾馬林誘導雙時相的自發(fā)性疼痛。但當在足底預注射PD-L1 (1～10 μg)時，第二時相的疼痛行為被顯著抑制，而且高劑量（5或10 μg）還能輕度抑制第一時相的疼痛行為。von Frey檢測顯示，足底注射PD-L1 (5 μg)能提高正常小鼠對機械性刺激的縮爪閾值。

2.PD-L1是內(nèi)源性疼痛抑制劑，通過PD-1改變基礎疼痛閾值

惡性腫瘤組織能表達PD-L1，在癌癥免疫治療中PD-1可作為預測性的生物標志物。ELISA檢測顯示小鼠黑色素瘤組織高表達PD-L1（約450 ng/mg）。培養(yǎng)的黑色素瘤細胞也能分泌PD-L1。對正常組織中的PD-L1的檢測顯示：非神經(jīng)組織，如肝、脾、腎中含較高水平的PD-L1（約70～90 ng/mg）。神經(jīng)組織中，包括腦、脊髓、DRG，PD-L1含量約為50 ng/mg。此外，坐骨神經(jīng)和后爪皮膚中含有少量的PD-L1。原位雜交也顯示DRG神經(jīng)元中表達Pdl1 mRNA。表明PD-L1在神經(jīng)組織和皮膚中廣泛存在。

非惡性腫瘤組織中內(nèi)源性的PD-L1是否參與疼痛調(diào)節(jié)？小鼠足底注射可溶性PD-1(sPD-1)中和小鼠后爪中PD-L1后，誘導了短暫的機械性觸誘發(fā)痛，但沒有出現(xiàn)自發(fā)性疼痛。用PD-1中和抗體RMP1-14也能誘導出約3小時的機械性觸誘發(fā)痛。Nivolumab（也稱為Opdivo）是美國食品藥品監(jiān)督管理局批準的完全人化的IgG4單克隆抗體，其選擇性作用于PD-1。足底注射nivolumab能誘導機械性觸誘發(fā)痛。另外，PD-L1的鎮(zhèn)痛作用可被RMP1-14和nivolumab阻斷，說明PD-L1經(jīng)PD-1抑制疼痛。

用Pd1基因敲除小鼠行為檢測顯示：Pd1基因敲除后基礎疼痛敏感性增加。PD-L1誘導的鎮(zhèn)痛效應和RMP1-14誘導的痛覺敏化在Pd1基因敲除后不再出現(xiàn)。Pd1基因敲除小鼠DRG中CGRP，IB4和NF200表達正常。這些結果表明：①PD-L1是內(nèi)源性疼痛抑制物；②PD-L1經(jīng)PD-1產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應，③Pd1基因敲除小鼠疼痛敏感性改變不是感覺神經(jīng)元發(fā)育缺陷所致。

3.PD-L1經(jīng)PD-1抑制小鼠DRG神經(jīng)元的活動

原位雜交顯示Pd1 mRNA在DRG大中小神經(jīng)元內(nèi)均表達。免疫組化顯示PD-1蛋白在幾乎所有的DRG神經(jīng)元內(nèi)表達。PD-1免疫陽性信號也存在于CGRP陽性纖維中。這些結果說明，外周初級感覺神經(jīng)元能表達PD-1，提示PD-1具有調(diào)節(jié)疼痛的神經(jīng)基礎。

通常激活或敏化傷害性感覺神經(jīng)元（傷害性感受器）誘發(fā)疼痛和痛覺過敏，PD-L1/PD-1信號是否通過調(diào)節(jié)傷害性感受器活動來抑制疼痛？作者用全細胞膜片鉗記錄了分離打散的小鼠DRG的小型神經(jīng)元的興奮性（直徑 ＜ 25 μm）。結果顯示：PD-L1在非常低濃度時(10 ng/ml)就能快速抑制動作電位的產(chǎn)生，也能提高基強度（引起動作電位的最小電流強度），PD-L1還能誘導DRG神經(jīng)元靜息膜電位(RMP)的超極化效應，這些效應在Pd1基因敲除后消失，表明PD-L1經(jīng)PD-1調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性。而且，Pd1基因敲除后DRG神經(jīng)元的RMP和動作電位的發(fā)放頻率增加，表明Pd1基因敲除小鼠的傷害性感受器興奮性增強。

與完全打散的DRG神經(jīng)元相比，整體DRG能保留細胞外隙中的PD-L1。在整體DRG上的實驗顯示，用sPD-1 (30 ng/ml)中和PD-L1后，DRG小型神經(jīng)元動作電位的放電頻率增加。用nivolumab阻斷PD-1也能增加動作電位頻率。以上研究表明PD-L1和PD-1在調(diào)節(jié)傷害性感覺神經(jīng)元興奮性中非常重要。

4.PD-L1抑制神經(jīng)損傷后DRG神經(jīng)元的過度興奮和神經(jīng)病理性疼痛

神經(jīng)損傷后初級感覺神經(jīng)元的過度興奮與慢性疼痛密切相關。在慢性坐骨神經(jīng)壓迫性損傷(CCI)誘導的神經(jīng)病理性疼痛小鼠，游離的整體DRG傷害性神經(jīng)元興奮性增加，這種增加能被PD-L1抑制。而且，鞘內(nèi)注射PD-L1減輕了CCI誘導的機械性觸誘發(fā)痛和熱痛覺過敏。

5.PD-L1抑制脊髓背角突觸傳遞和損傷誘導的脊髓神經(jīng)元的過度興奮

脊髓薄片的全細胞膜片鉗記錄顯示：PD-L1能快速降低脊髓II外層神經(jīng)元自發(fā)性突觸后電流(sEPSCs)的頻率和振幅。而sPD-1和nivolumab孵育后增加了脊髓II外層神經(jīng)元sEPSC的頻率。PD-L1對sEPSC抑制作用能被nivolumab阻斷。因此，PD-L1/PD-1信號在調(diào)節(jié)脊髓傷害性信息傳遞中發(fā)揮作用。隨后，作者檢測了PD-L1在骨癌痛模型上的中樞作用。骨癌細胞浸潤2周后，鞘內(nèi)注射PD-L1能減輕骨癌誘導的機械性觸誘發(fā)痛。而且，PD-L1減輕了骨癌誘發(fā)的脊髓背角廣動力(WDR)神經(jīng)元的過度興奮，但nivolumab卻能增強WDR神經(jīng)元的活動。這些數(shù)據(jù)顯示PD-L1在外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)均作為神經(jīng)調(diào)質發(fā)揮作用；在脊髓背角，PD-L1/PD-1通過抑制傷害性突觸傳遞和損傷誘導的神經(jīng)元可塑性調(diào)節(jié)急慢性疼痛。

6.PD-L1經(jīng)SHP-1調(diào)節(jié)DRG神經(jīng)元的鈉電流和TREK2鉀通道

PD-L1如何調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性呢？在免疫細胞，PD-1被PD-L1激活后募集酪氨酸磷酸酶（SHP-1和SHP-2）來介導PD-L1的作用。鞘內(nèi)注射PD-L1后DRG神經(jīng)元SHP-1被激活，并且它們共存在同一神經(jīng)元內(nèi)。這個激活作用和PD-L1的鎮(zhèn)痛作用可被SHP-1抑制劑SSG阻斷。說明DRG神經(jīng)元SHP-1不僅是PD-1下游信號，而且參與PD-L1鎮(zhèn)痛。

DRG神經(jīng)元鈉通道在動作電位和疼痛中起重要作用，實驗顯示PD-L1能抑制瞬時鈉電流，這種抑制可部分被SSG阻斷。鉀通道TREK2能調(diào)節(jié)DRG傷害性神經(jīng)元RMP。在共表達PD-1和TREK2的CHO細胞上，PD-L1能使RMP超極化、增強TREK2誘導的電流、使反轉電位負移。這些作用能被SSG阻斷。表明PD-1被PD-L1激活后經(jīng)SHP-1通過抑制鈉通道和增強TREK2通道功能來調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性。

7.人類DRG神經(jīng)元表達功能性的PD-1

目前疼痛治療的轉化醫(yī)學是個難題。進一步在人類DRG神經(jīng)元的研究顯示，人類DRG神經(jīng)元也表達PD-1。而且PD-L1能抑制人DRG傷害性神經(jīng)元的興奮性，該抑制作用也能被SSG阻斷，與小鼠的結果一致。

8.PD-L1和PD-1能掩蓋黑色素瘤小鼠的自發(fā)性疼痛和觸誘發(fā)痛

黑色素瘤表達大量的PD-L1，而且黑色素瘤小鼠沒有癌痛的行為表現(xiàn)。但是，足底注射sPD-1能很快誘發(fā)自發(fā)性疼痛和機械性觸誘發(fā)痛，且導致條件性位置偏好（CPP，作為持續(xù)性疼痛檢測指標）。然而，免疫指標不受sPD-1的影響。在坐骨神經(jīng)注射PD-1 siRNA能下調(diào)DRG神經(jīng)元PD-1表達，并誘導黑色素瘤小鼠出現(xiàn)自發(fā)性疼痛和機械性觸誘發(fā)痛。因而PD-1的表達足以掩蓋黑色素瘤的癌痛。用nivolumab和RMP1-14靜脈注射后，黑色素瘤小鼠出現(xiàn)自發(fā)性疼痛和機械性觸誘發(fā)痛。SSG阻斷PD-1下游的信號也使黑色素瘤小鼠出現(xiàn)自發(fā)性疼痛。這些發(fā)現(xiàn)提示PD-L1經(jīng)PD-1和SHP來掩藏未轉移的黑色素瘤的癌痛。

總 結

目前盛行的觀點認為，在癌癥微環(huán)境中的促疼痛介質能激活或敏化初級傳入神經(jīng)元。本文闡明了癌組織也能產(chǎn)生對抗疼痛的介質PD-L1。PD-L1不僅由黑色素瘤組織產(chǎn)生，還能由非癌組織產(chǎn)生，如皮膚、DRG、脊髓。正常小鼠外源給予PD-L1能鎮(zhèn)痛，但阻斷內(nèi)源性PD-L1和PD-1能致痛。PD-L1能抑制急性炎癥性疼痛，也能通過外周和中樞作用減輕神經(jīng)病理性疼痛和骨癌痛。

本研究還證明PD-L1是一種神經(jīng)調(diào)質，它經(jīng)PD-1調(diào)節(jié)小鼠和人類DRG神經(jīng)元興奮性以及脊髓部位的突觸傳遞。形態(tài)學和電生理學證實小鼠和人類DRG神經(jīng)元上有PD-1表達，而且有功能。機制上，小鼠和人類DRG神經(jīng)元上PD-1被PD-L1激活后抑制動作電位和瞬時鈉電流。PD-L1經(jīng)PD-1和SHP以及TREK2來調(diào)節(jié)RMPs、導致超極化。在脊髓部位，PD-L1抑制痛覺神經(jīng)環(huán)路中脊髓II外層神經(jīng)元的sEPSCs。PD-L1還能減輕骨癌誘發(fā)的脊髓背角WDR神經(jīng)元的過度興奮。這些都說明PD-L1作為神經(jīng)調(diào)質在外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)疼痛敏化。由于PD-L1影響sEPSCs的頻率和振幅，因而PD-1還可能存在于脊髓和腦的突觸后神經(jīng)元上?？紤]到膠質細胞在疼痛病理中的重要作用，也不能排除PD-L1和PD-1在慢性疼痛狀態(tài)下調(diào)節(jié)膠質細胞功能。值得注意的是，PD-L1抑制病理性疼痛，不僅包括炎癥性、神經(jīng)病理性以及骨癌性疼痛模型，也包括黑色素瘤模型。而且PD-L1/PD-1軸在掩蓋黑色素瘤小鼠疼痛中起重要作用。

這些研究發(fā)現(xiàn)提醒醫(yī)生，患有黑色素瘤或其他惡性腫瘤的病人需要在免疫治療前中后檢查病人的疼痛狀況。也提醒科研工作者，研究癌細胞釋放某些特定的疼痛抑制物將為未來疼痛治療提供新的途徑，PD-L1/PD-1信號通路可能是其中之一。

（Gang Chen, Yong Ho Kim, Hui Li, et al. Nat Neurosci, 2017,20(7):917-926. 南通大學，張志軍 譯 高永靜 校）

10.3969/j.issn.1006-9852.2017.10.002