黃 明 孫瑩杰△ 張鐵錚 李 凱 鄭昊龍 何寶文 陳克研

(1沈陽軍區(qū)總醫(yī)院麻醉科，沈陽 110016；2沈陽市第四人民醫(yī)院麻醉科，沈陽110031)

低強度激光修復(fù)術(shù)對小型巴馬豬退變椎間盤水通道蛋白-3表達的影響*

黃 明1#孫瑩杰1#△張鐵錚1李 凱2鄭昊龍1何寶文1陳克研1

(1沈陽軍區(qū)總醫(yī)院麻醉科，沈陽 110016；2沈陽市第四人民醫(yī)院麻醉科，沈陽110031)

目的：通過構(gòu)建小型巴馬豬椎間盤退行性病變模型，觀察低強度激光對豬椎間盤水通道蛋白-3(Aquaporin-3，AQP-3) 表達的影響。方法：小型巴馬豬9頭，隨機分為對照組 (Con組)，造模組 (Mod組)及激光治療組 (Las組)，每組3頭。Con組不進行任何處理，Mod組及Las組在C形臂X光引導下利用16G針刺入豬L2-3、L3-4、L4-5、L5-6椎間盤進行破壞，Las組豬椎間盤退變模型建立1個月后，對已處理的椎間盤進行低能量激光治療再觀察1個月，進行MR檢測，并取椎間盤HE染色、免疫組化及Western檢測AQP-3的表達情況。結(jié)果：三組在造模前、造模后1個月、治療后1個月，Con組豬的椎間盤T2加權(quán)像呈高信號，Mod組信號強度明顯下降，Las治療組呈中、高信號影。HE染色Con組結(jié)構(gòu)完整，Mod組結(jié)構(gòu)遭到破壞，Las組結(jié)構(gòu)較Mod組顯著恢復(fù)。與Con組比較，Mod組和Las組豬椎間盤的AQP-3表達均顯著降低 (P ＜ 0.05)，而Las組AQP-3表達較Mod組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)。結(jié)論：低強度激光對小型巴馬豬退變的椎間盤具有保護作用，其機制可能與上調(diào)其間盤組織水通道蛋白表達有關(guān)。

強度激光；椎間盤退化；巴馬豬；水通道蛋白-3

椎間盤突出是一個漫長的病理過程，椎間盤主要由纖維環(huán)、髓核以及上下終板構(gòu)成，其中髓核被富含水分的纖維環(huán)所包繞，髓核含水量較纖維環(huán)高，其髓核含水量約80%，纖維環(huán)含水量約為 65%。腰椎間盤退變的發(fā)生與發(fā)展是人體在生長發(fā)育停止后開始，多于25歲左右，纖維環(huán)與髓核相繼發(fā)生退變，髓核脫水及吸水功能減弱，體積減小，彈性下降，椎間盤內(nèi)壓力變化不均，導致軟骨終板損傷，導致椎間盤營養(yǎng)改變，椎間盤組織細胞成分改變，加速椎間盤退變，椎間盤退變導致纖維環(huán)出現(xiàn)裂痕，中央的髓核在受到周圍的壓力，在最薄弱處膨出、突出甚至脫出。

既往的研究顯示水通道蛋白-3 (Aquaporin-3，AQP-3) 與椎間盤退變有明顯的相關(guān)性[1～3]，AQP-3在椎間盤的生理代謝過程中具有重要的作用，可維持正常的滲透壓及能量的合成，參與維持椎間盤細胞的正常形態(tài)以及能量代謝[4,5]，本文通過構(gòu)建小型巴馬豬椎間盤退行性病變動物模型,探討低強度激光修復(fù)術(shù)對豬椎間盤退行性病變的作用及其水通道蛋白-3表達的影響，為低能激光技術(shù)用于治療椎間盤突出疾病，提供可靠的實驗依據(jù)。

方 法

1.動物分組

健康成年小型巴馬豬9頭，雌雄不限，體重50～60 kg，由沈陽軍區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學實驗動物科提供。按照隨機數(shù)字表法，將上述巴馬豬隨機分為3組，每組3頭，分別為空白對照組 (Con組)，造模組 (Mod組)和低能量激光治療組 (Las組)。Con組不進行任何處理，進行觀察2個月，Mod組建立豬椎間盤退變模型后再觀察2個月，Las組建立豬椎間盤退變模型觀察1個月進行低能量激光治療，再觀察1個月。

2.模型的建立及處理

術(shù)前取耳緣靜脈穿刺建立靜脈通路，靜脈給予3 mg/kg丙泊酚實施麻醉。麻醉成功后，將小型巴馬豬以左側(cè)位躺臥在具有C形臂X線引導的手術(shù)臺上，持續(xù)泵入丙泊酚8 ml/h維持麻醉，術(shù)中監(jiān)測生命體征。術(shù)中靜脈輸注生理鹽水，并給與160萬單位青霉素預(yù)防感染。

參照文獻[6]報告的方法建立椎間盤退行性變模型。在C形臂X線引導下確定豬L2-3、L3-4、L4-5、L5-6椎間隙，用1%的利多卡因進行浸潤麻醉，用16 G的引導針沿定位點穿刺椎間盤。穿透纖維環(huán)后側(cè)后，呈放散狀將椎間盤進行針刺破壞。術(shù)后連續(xù)應(yīng)用3天青霉素80萬單位，每日觀察大小便以及飲食情況，1周后去除敷料，術(shù)后1個月行MR檢測驗證模型是否成功。

在造模成功1個月后，對造模的椎間盤進行低強度激光治療。C形臂X線引導下確定針尖位置無誤后，沿著引導針向椎間盤中間導入直穿刺針。向穿刺針中導入外徑為400 μm的光纖，光纖連于激光設(shè)備，設(shè)置激光器功率3瓦，預(yù)設(shè)能量900焦耳。激光輻射時間（曝光時間）30秒。波長λ = 970 nm (0.97 μm)的激光輻射強度為3 W。輻射能量為90焦耳。激光作用后，注入少量(0.2～0.5 ml)生理鹽水。借助影像確定彎頭針的位置，拔出引導針。將彎頭針拉近纖維環(huán)部位，然后重新向前進入髓核內(nèi)直至相同深度，重復(fù)3～5次。

3.豬椎間盤影像學檢查

在豬進行造模前、造模后1個月、手術(shù)后1個月分別進行MR檢測，觀察椎間盤狀態(tài)，每次行MR檢查均將豬進行全麻，并監(jiān)測生命體征。進行MR后密切觀察豬的飲食及二便3天，一切均正常后，進行統(tǒng)一飼養(yǎng)。并運用P fi rrmann分級系統(tǒng)對椎間盤進行評估[6]。

4.標本采集與檢測

2個月后，三組豬頸動脈放血處理，游離相對應(yīng)椎間盤，取出纖維環(huán)，放于-80℃冰箱保存，采用Western Blot方法檢測APQ-3的表達，另取椎間盤組織(每只豬取L2-3、L3-4、L4-5、L5-6共4個椎間盤)，連同上、下部分椎體，固定于甲醛，脫鈣行組織切片，片厚5 μm。常規(guī)蘇木精-伊紅染色。所有椎間盤組織標本用10%甲醛常規(guī)固定，椎間盤EDTA液脫鈣,經(jīng)脫水、透明、包埋，連續(xù)5μm橫斷面切片，其中一片HE染色，觀察每個正中矢狀面椎間盤，并留影。

5.統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，兩變量間相關(guān)性分析用Person相關(guān)分析，以P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.影像學觀察

如圖1所示，在Con組椎間盤纖維環(huán)呈中等信號，髓核呈高信號影,纖維環(huán)信號略有不均勻，局部呈低信號影；在Mod組椎間隙變窄，椎間盤后突，硬膜囊受壓，髓核信號基本喪失，椎間盤變形；在Las組脊柱形態(tài)也出現(xiàn)了一定的退行性改變，髓核呈中高信號，間盤出現(xiàn)一定的形變，信號有部分缺失，部分區(qū)域呈低信號影，但基本完整，由于造模過程中對組織損傷較大，部分椎體高度發(fā)生明顯變化。

影像學分級結(jié)果如表1所示， 通過表1椎間盤影像學分級統(tǒng)計得出結(jié)果。Con組中的MR影像均為Ⅰ-Ⅱ級，未見明顯的退變征象；Mod組中主要以Ⅲ-Ⅳ級為主，可見明顯的退行性改變；Las組以Ⅱ-Ⅲ級為主，退變輕； Con組椎間盤的Ⅰ、Ⅱ級總數(shù)為100%、Mod組Ⅰ、Ⅱ級總數(shù)為16.7%、Las組Ⅰ、Ⅱ級總數(shù)為58.3%。

2.豬椎間盤組織形態(tài)學變化

肉眼觀察椎間盤組織可發(fā)現(xiàn)，Con組椎間盤未見明顯退變,髓核呈白色膠凍狀、含水量多,結(jié)構(gòu)清晰，纖維環(huán)與髓核之間有較為明顯的分界，纖維環(huán)結(jié)構(gòu)清楚、呈同心圓樣排列，Thompson分級為I級；而Mod組的椎間盤可見明顯的退化征象，纖維環(huán)局部出現(xiàn)明顯破裂帶，可見一個瘢痕樣針刺通道,貫穿整個纖維環(huán)及髓核，周圍出現(xiàn)硬化，Thompson分級分劃分至Ⅲ-Ⅳ級；Las組椎間盤厚度下降,間質(zhì)成分有所減低，髓核顏色為灰白色，纖維環(huán)與髓核之間分界略模糊，髓核周圍出現(xiàn)白色纖維樣組織，Thompson分級為Ⅱ-Ⅲ級(見圖2)。

HE染色顯示：Con組椎間盤組織結(jié)構(gòu)較清晰，軟骨基質(zhì)豐富，走形清楚，排列有序，細胞眾多，胞核較小，呈圓形，位于中央,纖維環(huán)結(jié)構(gòu)正常；Mod組組織結(jié)構(gòu)紊亂，膠原纖維變大、走形不規(guī)則，并有炎性始終及壞死，纖維增粗，并出現(xiàn)玻璃樣變性，髓核細胞減少，纖維排列紊亂，分層不清晰，膠原纖維重度扭曲,部分斷裂。細胞數(shù)目明顯減少，胞核增大，細胞介于軟骨細胞和纖維細胞；Las組髓核內(nèi)部可見裂隙,細胞形態(tài)發(fā)生改變,細胞結(jié)構(gòu)尚清晰，排列出現(xiàn)輕微的紊亂，細胞數(shù)中等，胞核與胞漿比例基本正常，并伴有輕微的炎性壞死及滲出(見圖3，表2)。

圖1 各組小型巴馬豬椎間盤MR檢測結(jié)果Fig.1 MRI results of intervertebral discs of Bama miniature pigs

表1 椎間盤影像學分級統(tǒng)計表Table 1 Intervertebral disc imaging grading table

表2 三組豬椎間盤病理分級表Table2 Pathological grading table of three groups of porcine intervertebral disc

圖2 三組小型巴馬豬間盤大體病理改變Fig.2 Gross pathological changes of plate among the three group

圖3 三組巴馬小型豬椎間盤病理組織學變化 HE染色Fig.3 Histopathological changes of intervertebral discs in three groups of Bama miniature pigs by HE staining

3.間盤纖維化AQP-3表達的變化

如圖4所示，細胞漿染為棕黃色或棕褐色為陽性表達。Con組間盤切片有明顯陽性表達,細胞漿被染為棕黃色或棕褐色；Mod組幾乎無陽性顆粒，結(jié)構(gòu)紊亂；Las組可見部分表達染色明顯減弱，陽性細胞數(shù)目較Con組明顯減少，但明顯多于Mod組。

4.Western Blot檢測結(jié)果顯示

與Con組比較，Mod組和Las組的AQP-3表達明顯減弱，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)；與Mod組比較，Las組的AQP-3表達顯著增加 (P ＜ 0.05，見圖5)。

WB結(jié)果顯示，對照組(Con組) AQP-3的表達明顯較造模組(Mod組)及激光組(Las組)顯著升高(P ＜ 0.05)。AQP-3在Mod組WB的表達較弱，條帶較窄；與Mod組相比，Las組的表達顯著升高 (P ＜ 0.05)。

圖4 三組小型巴馬豬椎間AQP-3免疫組化變化Fig.4 AQP-3 change among three group

圖5 三組巴馬小型豬椎間盤AQP-3 WesternBlot結(jié)果Fig.5 Western Blot Results of AQP3 in three groups of Bama miniature pig intervertebral discs*P ＜ 0.05，與 Mod 組及 Las組比較；#P ＜ 0.05，與 Mod組度比較

討 論

近年來， AQPs在間盤細胞水及營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運越來越被大家所認同。AQPs是一種小分子疏水性跨膜蛋白，大小約為26-34 kD,可選擇性通透水，廣泛存在于動、植物及微生物中。由于成人椎間盤缺少血液供應(yīng)，軟骨終板和纖維環(huán)的AQPs可能在椎間盤營養(yǎng)供應(yīng)和代謝過程中起重要作用。Richardson等[3]研究發(fā)現(xiàn)在人纖維環(huán)及髓核中有AQP-1、AQP-3的表達,而無AQP-2表達,在外層纖維環(huán)中有少量的AQP-3表達而無AQP1表達,原野等也在退行性變的椎間盤中發(fā)現(xiàn)AQP-3的表達明顯低于正常的椎間盤組織[7,8]。

椎間盤內(nèi)正常流體力學功能喪失是啟動椎間盤退變的共同通路,間盤所承受的壓力負荷不斷變化，其內(nèi)水分的含量也隨壓力的改變而改變，液體的轉(zhuǎn)運對間盤的彈性異常重要。正常間盤在不斷活動中產(chǎn)生形變，所以水份進出間盤的速度也很快。纖維環(huán)為致密的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，單純彌散不足以解釋這一生理現(xiàn)象。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)椎間盤中有AQPs的表達，AQPs在椎間盤維持脊柱穩(wěn)定、緩沖和均勻分配中發(fā)揮重要作用[9～13]。

目前治療椎間盤突出比較成熟方法是通過椎間盤微創(chuàng)技術(shù)對突出部分切除或者通過高溫熱凝技術(shù)將突出的髓核進行消融。雖說暫時解決了突出壓迫的問題，但可能對椎間盤造成不可逆的損傷，難以保證長期效果，低能激光這項技術(shù)的獨創(chuàng)性在于，它不追求在椎間盤中建立所謂的一般認為在負壓作用下“突出體組織”會向之移動的“儲備腔”，取而代之的是在椎間盤中形成總體積小于椎間盤體積1%的若干細小渠道。通過多通道激光穿刺椎間盤重構(gòu)修復(fù)術(shù)使用0.97 μm波長的輻射，減小了對椎間盤的破壞，又對突出的髓核進行治療，通過多通道激光穿刺椎間盤重構(gòu)修復(fù)術(shù)，可以顯著地擴大經(jīng)皮激光穿刺治療腰椎間盤源性疾病的適應(yīng)癥范圍，并最大程度上不損傷椎間盤本身的結(jié)構(gòu)[14,15]。

本實驗通過小型巴馬豬來模擬臨床病人，制成與臨床相似的椎間盤退變模型。穿刺造模后1個月進行MR檢查，發(fā)現(xiàn)進行穿刺的椎間盤出現(xiàn)間隙變窄，椎間盤后突，硬膜囊受壓，髓核信號缺失，纖維環(huán)變形等改變，按照P fi rrmann分級標準，處理后的椎間盤在Ⅲ-Ⅳ級，提示造模成功。在造模成功1個月后，進行低強度激光治療，結(jié)果顯示，治療組椎間盤MRI P fi rrmann分級較模型組明顯降低，大體標本和HE染色結(jié)果也證實治療組椎間盤退行病變明顯減輕，提示低強度激光對椎間盤具有一定修復(fù)功能，并且低強度激光是通過生物波的形式，刺激周圍組織，在治療的過程中相對減少了對周圍椎間盤的破壞作用。

本研究結(jié)果顯示，模型組免疫組化示間盤切片幾乎無黃染顆粒。Las組陽性細胞數(shù)目明顯多于模型組，Wester檢測結(jié)果也顯示，激光治療組的AQP-3明顯增加。

本研究中獲得的標本均是手術(shù)摘除的椎間盤組織，由于初次進行椎間盤解剖，相對操作不是非常規(guī)范,肉眼較難分辨出椎間盤各個組織，在取材過程中可能會破壞周邊組織造成實驗誤差，加之樣本量相對不足，所以對同一頭豬的同一脊柱多次取材。這樣可能會從某種程度上影響實驗結(jié)果。

綜上所述，低強度激光修復(fù)術(shù)可通過生物波進行治療，對退變的椎間盤具有一定的保護和修復(fù)作用，其機制與上調(diào)水通道蛋白-3有關(guān)。

[1]Kageyamay, Sasaki S, Yamawra Y, et al. Water channel protein subtype suggests the origin of RCC. J Urol,1996, 156:291 ～ 295.

[2]李學軍.水通道的生物學研究.生命科學, 2003,15(6):383 ～ 390.

[3]Richardson SM, Knowles R, Maples D, et al. Aquaporin expression in the human intervertebral disc, J MolHist,2008, 39(3):303 ～ 309.

[4]Badaut J, LasbennesF, Magistretti PJ, et al. Aquaporins in brain: distribution, physiology,and pathophysiology.J Cereb Blood Flow Metab, 2002, 22(4): 367 ～ 378.

[5]曹國永,周躍,滕海軍,等.水通道蛋白在正常大鼠椎間盤組織中的表達與分布.中國矯形外科志,2005, 13(13):996 ～ 999.

[6]Sehulm DS, Rodriguez AG, Hansma PK, et al. Mechanieal Profiling of inter Vertebral dises. Biomech,2009, 42(8):1154 ～ 1157.

[7]李書忠,陳培動,胡有谷.正常椎間盤膠原的研究.生物化學雜志, 1993, 9(2):184 ～ 189.

[8]原野,趙靜,李永民,等.核因子κB、基質(zhì)金屬蛋白酶3.在退變腰椎間盤組織中的表達.中國組織工程研究與臨床康復(fù), 2011, 15(22):4111 ～ 4114.

[9]曹國永,周躍,滕海軍,等.水通道蛋白在正常大鼠椎間盤組織中的表達與分布.中國矯形外科雜志2005, 13(13):996 ～ 999.

[10]曹國永,楊渝勇,蔣勇,等.椎間盤退變過程中軟骨終板AQP3的表達變化.重慶醫(yī)學, 2011, 40(4):359 ～361.

[11]張樂穎,王加啟,卜登攀,等.水通道蛋白研究進展.中國畜牧獸醫(yī), 2008, 35(11):40 ～ 43.

[12]李健,朱豪東,顏登魯,等.水通道蛋白3在人正常椎間盤中的表達.中華實驗外科雜志, 2008, 25(6):790 ～ 791.

[13]張永濤. AQP-1、AQP-3在椎間盤退變中的作用.云南:大理學院, 2010.

[14]Eliott DM, Sarver JJ. Young investigator award winner validation of the mouse and rat disc as mechanical models of the human lumbar disc. Spine, 2004,29(7):713 ～ 722.

[15]TC Y, Liu SH. Biophotonics on low intensity laser.Chinese Journal of Laser Medicine& Surgery, 1997,6(3): 125 ～ 131.

THE INFLUENCE OF LOW-INTENSITY LASER ON THE EXPRESSION OF AQUAPORIN-3 IN DEGENERATIVE DISC OF THE MINIATURE BAMA PIG*

HUANG Ming1#, SUN Ying-Jie1#△, ZHANG Tie-Zheng1, LI Kai2, ZHENG Hao-Long1, HE Bao-Wen1,CHEN Ke-Yan1
(1Department of Anesthesia, General Hospital of Shenyang Military Command Area，Shenyang 110031,China;2Department of Anesthesia, NO.4 Hospital of Shenyang, Shenyang 110031, China)

Objective:To investigate the effect of low intensity laser irradiation on porcine intervertebral disc aquaporin-3 (AQP-3) expression by constructing the miniature Bama pig degenerative disc model. Methods: Nine miniature Bama pigs were randomly divided into three groups: control group (Con), model group (Mod) and laser treatment group (Las). Con group did not undergo any treatment, while the Mod group and the Las group underwent Type C arm X-ray guidance puncture with 16G needles to break down the L2-3, L3-4, L4-5, L5-6intervertebral discs. After one month, the discs were treated with low-energy laser treatment for another month. MR imaging was performed for 1 month. The expression of AQP-3 was detected by HE staining, immunohistochemistry and Western blot.Results:The T2-weighted images of the intervertebral discs showed a high signal intensity in the three groups before modeling, one month after modeling and one month after treatment. The signal intensity of the Mod group decreased significantly, and the signal intensity in the Las group was moderate and high compared with the Mod group.The structure of Con group was damaged and the structure of Las group was restored compared with Mod group.Compared with Con group, the expression of AQP-3 was signi fi cantly decreased in Mod and Las groups (P ＜ 0.05),but the expression of AQP-3 in Las group was signi fi cantly higher than Mod group (P ＜ 0.05) . Conclusion: Low intensity laser has a protective effect on degenerated intervertebral disc of Bama miniature pig, and its mechanism is possibly related to the up-regulation of aquaporin expression.

Low intensity laser; Intervertebral disc degeneration; Bama miniature pigs; AQP-3

10.3969/j.issn.1006-9852.2017.10.004

沈陽市科技計劃項目(No：F14-158-9-11)

#共同第一作者

△通訊作者 sunyingjie9@hotmail.com