陳晨 張永宏

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550001;2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，貴州 貴陽(yáng) 550001)

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△通信作者

帶熒光標(biāo)記的新型丙型肝炎病毒感染性克隆的構(gòu)建及其活性鑒定

陳晨1張永宏2△

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550001;2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，貴州 貴陽(yáng) 550001)

丙型肝炎病毒; 綠色熒光蛋白; mCherry; Huh7.5肝癌細(xì)胞; 感染

丙型肝炎病毒(HCV)屬于黃病毒科丙型肝炎病毒屬。研究[1]發(fā)現(xiàn)在HCV NS5A結(jié)構(gòu)域Ⅲ中可插入大量異源序列如綠色熒光蛋白(EGFP)，從而對(duì)HCV感染的活細(xì)胞進(jìn)行可視化研究。本次實(shí)驗(yàn)將探索利用新型全長(zhǎng)HCV感染性克隆(包括HCV基因2a型，同時(shí)構(gòu)建HCV基因5a型嵌合體)，建立帶有報(bào)告基因EGFP、mCherry的HCV基因2a及5a型的活病毒，在完整HCV生命周期的水平上研究感染情況，為尋找HCV新藥物提供治療靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料 人肝癌細(xì)胞系Huh7.5細(xì)胞、質(zhì)粒PJ6/JFH1-NS5Adel40EGFP(J6/JFH1-EGFP),PJ6/JFH1-NS5Adel40 mCherry(J6/JFH1-mCherry),YL21-2PSA135’UTR-NS2/JFH1(YL21),YL11 PJ65’UTR-NS2/JFH1(YL11)均為廣州中山大學(xué)病毒所提供。DMEM及新生牛血清購(gòu)自美國(guó) Gibco公司； T4-DNA 快速連接酶、NruI 內(nèi)切酶購(gòu)自美國(guó)NEB公司；SanDI、MreI等酶購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司；細(xì)胞轉(zhuǎn)染用脂質(zhì)體Lipofectamine 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；其他常用試劑為廣州中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)室自行配制。

1.2 方法

1.2.1 攜帶EGFP/mCherry報(bào)告基因質(zhì)粒的構(gòu)建 將目的基因J6/JFH1-EGFP、J6/JFH1-mCherry及載體YL21用SanDI和MreI雙酶切，回收攜帶報(bào)告基因EGFP或mCherry的片段，以T4 DNA快速連接酶連接，以空載體作對(duì)照。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli(Top10感受態(tài)),接種至LB(含氨芐AMP)平板，37 ℃孵箱過(guò)夜培養(yǎng)。

1.2.2 克隆鑒定及序列分析 挑取LB平板上生長(zhǎng)的單個(gè)菌落至LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，280 rpm,震搖培養(yǎng)16 h.取初篩陽(yáng)性的菌株小量提取質(zhì)粒，并用酶切以鑒定插入片斷。獲得新的帶有熒光蛋白的YP12pSA135’UTR-NS2/JFH1-NS5Adel40-EGFP(5a-EGFP)，YP13pSA135’UTR-NS2/JFH1-NS5Adel40-mCherry(5a-mCherry)。

1.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 Huh7.5肝癌細(xì)胞株用DMEM培養(yǎng)基,在37 ℃，5%CO2條件下接種于6孔板，3.5×105/孔細(xì)胞數(shù)，培養(yǎng)約20 h,待形成約90%細(xì)胞單層后,用Lipofectamine試劑盒轉(zhuǎn)染J6/JFH1-EGFP,J6/JFH1-mCherry，5a-EGFP,5a-mCherry,YL11。操作過(guò)程按產(chǎn)品使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4 EGFP/mCherry表達(dá)水平檢測(cè)及病毒滴度測(cè)定 轉(zhuǎn)染培養(yǎng)Huh7.5細(xì)胞在24 h、48 h、72 h、6 d、9 d、11 d、13 d直接在熒光顯微鏡下觀察熒光細(xì)胞。同時(shí)在上述時(shí)間點(diǎn)取含HCV病毒的轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清液感染新的Huh7.5細(xì)胞，感染16 h更換DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),24 h后通過(guò)熒光顯微鏡觀察熒光細(xì)胞了解感染性病毒顆粒釋放情況，通過(guò)計(jì)數(shù)被感染細(xì)胞的熒光灶點(diǎn)形成單位(FFU/mL)計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)液的病毒滴度。具體測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[2]報(bào)道進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 陽(yáng)性克隆酶切鑒定及序列測(cè)定 按照1.2.1設(shè)計(jì)進(jìn)行酶切獲得含有報(bào)告基因的目的條帶。通過(guò)酶切鑒定克隆成功。并挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列分析，插入片段與模板DNA完全一樣。

2.2 Huh7.5細(xì)胞熒光蛋白檢測(cè) 如箭頭所示見(jiàn)圖1。

注:A1及A2，分別是J6/JFH1-EGFP、J6/JFH1-mCherry;B1 及B2，分別是5a-EGFP、5a-mCherry;表示上述各病毒用轉(zhuǎn)染細(xì)胞 的培養(yǎng)上清液感染新的細(xì)胞后的熒光檢測(cè)結(jié)果(熒光顯微鏡放大 倍數(shù)40倍)。圖1 重組HCV RNA 感染后細(xì)胞熒光檢測(cè)

2.3 病毒滴度測(cè)定 根據(jù)1.2.4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果在病毒轉(zhuǎn)染Huh7.5細(xì)胞后測(cè)定其不同培養(yǎng)天數(shù)的FFU值。見(jiàn)表1。

表1 帶有EGFP/mCherry的重組體滴度測(cè)定結(jié)果

3 討 論

本次實(shí)驗(yàn)研究主體是分別帶有熒光蛋白標(biāo)記的含EGFP或mCherry病毒。通過(guò)熒光蛋白作為熒光標(biāo)記分子可以插入或是接合到目標(biāo)基因并轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中的方法，并運(yùn)用熒光顯微鏡成像實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)其活病毒轉(zhuǎn)染及感染到細(xì)胞的變化，被認(rèn)為是一種極強(qiáng)的標(biāo)記物。實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象是2a及5a嵌合體基因型的HCV病毒。利用J6-JFH1嵌合體病毒，將編碼熒光蛋白(GFP, RFP和VENUS-GFP)插入到NS5A區(qū)域，作為標(biāo)記，即JC1/RFP,JC1/GFP,VENUS-JC1，JFH-EGFP。這些RNA在轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞后，可產(chǎn)生活病毒[3]，表明NS5A結(jié)構(gòu)域Ⅲ允許插入外源基因，而不會(huì)嚴(yán)重?fù)p害病毒的復(fù)制[4]。本實(shí)驗(yàn)將帶有EGFP/mCherry的質(zhì)粒(J6/JFH1-EGFP,J6/JFH1-mCherry)分別插入到質(zhì)粒YL21中，成功的克隆出5a嵌合體5a-EGFP和5a-mCherry。并轉(zhuǎn)染到Huh7.5細(xì)胞中，熒光檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)EGFP/mCherry的表達(dá)，用其細(xì)胞培養(yǎng)上清液能感染新的Huh7.5細(xì)胞。通過(guò)對(duì)以上活病毒的收集，完成病毒滴度測(cè)定。

本研究成功致力于攜帶有報(bào)告基因的HCV克隆構(gòu)建，同時(shí)鑒定該類克隆的病毒活性，這為不同地區(qū)、不同人群HCV感染的自然史、臨床檢驗(yàn)、預(yù)后以及影響其轉(zhuǎn)歸的因素有哪些等一系列問(wèn)題提供了新的指導(dǎo)思路。

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R512.6+3，R735.7

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1000-744X(2016)03-0258-02

2015-10-18)