周雪冰 姜念 陸紅玲 歐剛衛(wèi)

(遵義醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，貴州 遵義 563003)

染料木素對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞與主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞黏附的影響

周雪冰 姜念 陸紅玲 歐剛衛(wèi)△

(遵義醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，貴州 遵義 563003)

目的 探討染料木素對(duì)脂多糖(LPS)同時(shí)誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞(THP-1)與人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)黏附的影響作用。 方法 分別培養(yǎng)THP-1細(xì)胞與HAEC細(xì)胞，用不同濃度染料木素預(yù)處理兩種細(xì)胞30 min，然后用LPS同時(shí)誘導(dǎo)兩種細(xì)胞4 h，將THP-1細(xì)胞加入到HAEC細(xì)胞中共培養(yǎng)1 h，用孟加拉玫瑰紅法檢測(cè)THP-1細(xì)胞與HAEC細(xì)胞黏附情況；用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)的濃度。結(jié)果 LPS能促使THP-1細(xì)胞與HAEC細(xì)胞黏附，促進(jìn) VCAM-1和ICAM-1釋放；加入染料木素后，兩種細(xì)胞的黏附量及VCAM-1和ICAM-1的釋放呈濃度依賴性減少(P<0.05)。結(jié)論 染料木素對(duì)脂多糖同時(shí)誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞與HAEC細(xì)胞的黏附有抑制作用。

染料木素； 脂多糖； 人單核細(xì)胞； 人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞； 黏附

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)是一個(gè)慢性炎癥過(guò)程[1]。在As的發(fā)病機(jī)制中，一個(gè)關(guān)鍵的早期事件是炎性因子誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞直接損傷，使其分泌大量炎性介質(zhì)，導(dǎo)致單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞相互黏附，隨后轉(zhuǎn)移到內(nèi)皮下[2]。此外，炎性因子還可激活單核細(xì)胞，使其釋放多種細(xì)胞因子間接激活內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)其表面多種黏附因子表達(dá)增強(qiáng)，引起內(nèi)皮細(xì)胞間接損傷，最終導(dǎo)致As的發(fā)生和發(fā)展[3]。染料木素是一種來(lái)源于豆科植物的天然生物活性物質(zhì)，在過(guò)去十年中,由于其具有多種生物學(xué)活性而引起廣泛的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，染料木素具有抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、抗炎、保護(hù)心血管等作用[4-6]。但目前的研究都僅局限于染料木素對(duì)單獨(dú)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的作用，而關(guān)于與單核細(xì)胞共存體系中內(nèi)皮細(xì)胞的功能狀態(tài)報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)同時(shí)誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞(THP-1)與人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(human aortic endothelial cell，HAEC)炎癥損傷并共培養(yǎng)的細(xì)胞模型，探討染料木素對(duì)共培養(yǎng)條件下THP-1細(xì)胞與HAEC細(xì)胞黏附的影響，以及血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)的激活和表達(dá)情況，為進(jìn)一步闡明染料木素的抗As機(jī)制提供新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

LPS購(gòu)自美國(guó)sigma公司；人ICAM-1及VCAM-1定量 ELISA試劑盒購(gòu)自北京誠(chéng)林生物科技有限公司；孟加拉玫瑰紅試劑購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；染料木素購(gòu)自美國(guó)sigma公司，用DMSO溶解配置成母液后儲(chǔ)存于-20 ℃?zhèn)溆茫褂脮r(shí)以無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋到所需濃度，DMSO終濃度為0.5%。

1.2 細(xì)胞來(lái)源及培養(yǎng)

HAEC細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)，THP-1細(xì)胞購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)，兩種細(xì)胞均由含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為含5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱，取狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為五組：(1)對(duì)照組，含無(wú)血清培養(yǎng)基；(2)LPS組，用100 ng/mL的LPS分別處理兩種細(xì)胞4 h；(3)不同濃度染料木素組：高劑量染料木素組(GH)、中劑量染料木素組(GM)、低劑量染料木素組(GL)，將染料木素各組分別加入100 μmol/L、10 μmol/L、0.1 μmol/L的染料木素作用30 min后，再與100 ng/mL的LPS作用4 h。

1.4 孟加拉玫瑰紅法[7]檢測(cè)THP-1細(xì)胞與HAEC細(xì)胞的黏附情況

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期HAEC細(xì)胞種于96孔板中，每孔1×104個(gè)，培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后，棄去舊培養(yǎng)基，用PBS清洗1次，按上述實(shí)驗(yàn)分組加入不同濃度(100 μmol/L、10 μmol/L、0.1 μmol/L)的染料木素培養(yǎng)液100 μL/孔，置于培養(yǎng)箱中孵育30 min，吸棄原培養(yǎng)基，加入100 ng/mL的LPS繼續(xù)培養(yǎng)4 h；同時(shí)，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的THP-1細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基種于另一96孔板內(nèi)，每孔3×104個(gè)，同樣按照要求，加入不同濃度染料木素處理細(xì)胞并置于培養(yǎng)箱中孵育30 min后，吸棄原培養(yǎng)基，加入100 ng/mL的LPS繼續(xù)培養(yǎng)4 h。另設(shè)單加空白培養(yǎng)基組以及單加100 ng/mL的LPS組作為對(duì)照組。待兩種細(xì)胞分別孵育4 h后，將THP-1細(xì)胞加入到HAEC細(xì)胞中，再置培養(yǎng)箱中共孵育1 h。棄原培養(yǎng)基，用無(wú)菌PBS每孔清洗1次，去除未黏附的THP-1，每孔加入100 μL 0.25%的孟加拉玫瑰紅反應(yīng)液，室溫作用5 min，吸棄染料，用無(wú)菌PBS每孔清洗2次，加入終止液(PBS∶無(wú)水乙醇=1∶1)200 μL/孔，室溫作用30 min后，酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的光密度值(A值)，A值越大代表黏附量越多。

1.5 酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中VCAM-1、ICAM-1的釋放

將HAEC細(xì)胞種于24孔板中，每孔10×104個(gè)，培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后，棄去舊培養(yǎng)基，用PBS清洗1次，按上述實(shí)驗(yàn)分組加入不同濃度(100 μmol/L、10 μmol/L、0.1 μmol/L)染料木素培養(yǎng)液500 μL/孔，置于培養(yǎng)箱中孵育30 min，吸棄原培養(yǎng)基，加入100 ng/mL的LPS繼續(xù)培養(yǎng)4 h；同時(shí)，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的THP-1細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基種于另一96孔板內(nèi)，每孔3×104個(gè)，同樣按照要求，加入不同濃度染料木素處理細(xì)胞并置于培養(yǎng)箱中孵育30 min后，吸棄原培養(yǎng)基，加入100 ng/mL的LPS繼續(xù)培養(yǎng)4 h。另設(shè)單加空白培養(yǎng)基組以及單加100 ng/mL的LPS組作為對(duì)照組。待兩種細(xì)胞分別孵育4 h后，將THP-1細(xì)胞加入到HAEC細(xì)胞中，再置培養(yǎng)箱中共孵育1 h。將細(xì)胞培養(yǎng)液收集至干凈離心管中2 500 r/min離心20 min，再吸取上清液至干凈EP管中備用，按ELISA試劑盒的檢測(cè)步驟逐步操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度LPS同時(shí)誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞與HAEC細(xì)胞黏附的影響

用10ng/mL、100ng/mL及1μg/mLLPS分別刺激THP-1細(xì)胞、HAEC細(xì)胞4h后，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用100ng/mLLPS刺激細(xì)胞黏附最顯著，見(jiàn)表1、圖1。因此后續(xù)試驗(yàn)選擇100ng/mLLPS作用細(xì)胞。

分 組 THP-1細(xì)胞與HAEC細(xì)胞黏附(A490) 空白對(duì)照組0.139±0.22810ng/mL0.154±0224100ng/mL0.226±0.036*1μg/mLLPS0.175±0.039

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05。

圖1 不同濃度LPS對(duì)THP-1細(xì)胞及HAEC細(xì)胞黏附的影響

2.2 染料木素對(duì)LPS同時(shí)誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞與HAEC細(xì)胞黏附的影響

兩種細(xì)胞分別加入100ng/mLLPS刺激前30min加入不同濃度染料木素預(yù)處理后，與單用LPS組比較，隨著染料木素濃度的增加，兩種細(xì)胞的黏附量逐漸減少(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖2。

分 組THP-1細(xì)胞與HAEC細(xì)胞黏附(A490)對(duì)照組0.162±0.006*LPS0.254±0.020GL0.241±0.020GM0.200±0.019*GH0.174±0.007*

注：與LPS組比較，*P<0.05。

圖2 不同濃度染料木素對(duì)LPS同時(shí)誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞與HAEC細(xì)胞黏附的影響

2.3 應(yīng)用ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VCAM-1、ICAM-1的含量

與對(duì)照組比較，應(yīng)用LPS同時(shí)處理兩種細(xì)胞4h后，能顯著增加細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VCAM-1、ICAM-1的含量(P<0.01)，與LPS組比較，染料木素呈濃度依賴性地抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VCAM-1、ICAM-1的釋放。見(jiàn)表3。

分組VCAM-1(μg/L)ICAM-1(ng/L)對(duì)照組 786±124**605±79.92**LPS組1116±13.71788±36.16GL組962±92.35**768±20.80GM組840±37.49**699±6.52*GH組804±51.20**628±52.15**

注：與LPS組比較,*P<0.05，**P<0.01。

3 討 論

大多數(shù)研究認(rèn)為，As從發(fā)生發(fā)展到轉(zhuǎn)歸的全過(guò)程就是一個(gè)慢性的炎癥過(guò)程，眾多炎癥細(xì)胞和炎癥介質(zhì)參與其中[8-9]。高血脂、糖尿病、細(xì)菌和病毒感染等動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)因素均可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展。其中，微生物感染是As發(fā)生發(fā)展的協(xié)同誘發(fā)因素之一。LPS作為一種強(qiáng)烈的炎癥啟動(dòng)因子可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，其表達(dá)的黏附分子和化學(xué)誘導(dǎo)物能促進(jìn)炎性單核細(xì)胞黏附到血管壁而加劇內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，引發(fā)As的病理生理改變[10-11]。并且LPS還可通過(guò)激活單核細(xì)胞，使其釋放多種細(xì)胞因子，引起內(nèi)皮細(xì)胞的間接損傷。血液中的炎性細(xì)胞與血管內(nèi)皮黏附是As早期啟動(dòng)的關(guān)鍵。血液中單核-巨噬細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附是前者進(jìn)入血管壁的前提，而活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的高表達(dá)是誘導(dǎo)炎性細(xì)胞向血管壁黏附和浸潤(rùn)的分子基礎(chǔ)。本研究發(fā)現(xiàn)，致炎因子LPS能夠促進(jìn)THP-1細(xì)胞與HAEC細(xì)胞的黏附，且在100ng/mL時(shí)作用明顯，這與張振等的報(bào)道一致。

染料木素又被稱為染料木黃酮、金雀異黃素，它具有弱的雌激素效應(yīng)，在藥理劑量時(shí)是一個(gè)著名的非特異性酪氨酸激酶抑制劑[12]?，F(xiàn)有研究表明，染料木素具有抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、抗炎、保護(hù)心血管等作用。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS能夠促進(jìn)THP-1細(xì)胞與HAEC細(xì)胞黏附，而染料木素能夠有效抑制LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞與HAEC細(xì)胞黏附，提示染料木素對(duì)單核細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥損傷有一定保護(hù)作用。

有研究顯示，載脂蛋白E缺陷的小鼠血管內(nèi)皮易于發(fā)生粥樣硬化的部位，其VCAM-1、ICAM-1 的表達(dá)上調(diào)；如將小鼠的單核趨化蛋白-1(monocytechemotacticprotein-1，MCP-1 )或VCAM-1 基因敲除，其粥樣硬化病變則明顯減少，提示趨化因子或細(xì)胞黏附分子在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。而ICAM-1、VCAM-1可促進(jìn)炎性細(xì)胞尤其是單核細(xì)胞的遷移與浸潤(rùn)，可吸引大量單核細(xì)胞進(jìn)入內(nèi)皮下成為泡沫細(xì)胞而促進(jìn)As的發(fā)生、發(fā)展[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LPS作用后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞培養(yǎng)液中ICAM-1和VCAM-1的含量明顯增加。推測(cè)LPS可通過(guò)激活培養(yǎng)細(xì)胞釋放黏附分子，促進(jìn)兩種細(xì)胞的黏附；而加入染料木素后能夠顯著抑制LPS同時(shí)誘導(dǎo)的兩種細(xì)胞釋放ICAM-1和VCAM-1，且其作用呈濃度依賴性。

綜上所述，染料木素能夠通過(guò)下調(diào)ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)，有效抑制LPS同時(shí)誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞與HAEC細(xì)胞的黏附，這為臨床研制預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物提供了依據(jù)。但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

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Effect of genistein on the adhesion of monocytes and endothelial cells induced by lipopolysaccharide

ZhouXuebing,JiangNian,LuHongling,OuGangwei,

DepartmentofBiochemistry,ZunyiMedicalUniversity,Zunyi563003,China.

Objective To investigate the effect of genistein on the adhesion of monocytes and endothelial cells induced by lipopolysaccharide (LPS). Methods After human monocytes (THP-1) and human aortic endothelial cells (HAEC) were pretreated with genistein for 30 minutes and then induced with LPS for 4 hours respectively, the THP-1 cells were co-cultured with the HAEC cells for 1 hours. The adhesion between THP-1 and HAEC was detected by Rose Bengal, and the protein expression levels of ICAM-1 and VCAM-1 in the supernatant of the cultured cells were detected by ELISA. Results The adhesion effect between THP-1 and HAEC was increased significantly and the secretion of VCAM-1 and ICAM-1 was raised when the two cell lines were treated by LPS for 4 hours respectively. After administrating with genistein, both the adhesion rate of two cell lines and expression levels of VCAM-1 and ICAM-1 were reduced in a concentration-dependent manner. Conclusion Genistein can inhibite the adhesion effect of monocytes to endothelial cells induced by LPS.

Genistein; Lipopolysaccharide; Human monocytes； Human aortic endothelial cells； Adhesion

貴州省科技廳聯(lián)合基金重點(diǎn)項(xiàng)目資助課題[黔科合J字LKZ(2013)14]

R-33

A

1000-744X(2016)02-0127-04

2015-07-16)

△通信作者