閆津津，余 昊，王美玲

(1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東深圳 518000；2.北京大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100034)

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·論 著·

3種方法測定變應(yīng)性鼻炎患者的變應(yīng)原試驗(yàn)結(jié)果比較

閆津津1，余 昊1，王美玲2

(1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東深圳 518000；2.北京大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100034)

目的 通過斑點(diǎn)免疫印跡法(dot-IBT)、熒光酶聯(lián)免疫法(FEIA)測定變應(yīng)性鼻炎患者血清的變應(yīng)原特異性IgE(sIgE)，皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)(SPT)檢測變應(yīng)原，比較分析體外dot-IBT、FEIA與體內(nèi)SPT的結(jié)果,為臨床提供準(zhǔn)確可靠的sIgE實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。方法 37例變應(yīng)性鼻炎患者采用dot-IBT、FEIA檢測sIgE、SPT測定變應(yīng)原,分別分析dot-IBT、FEIA的特異度和靈敏度，通過Kappa檢驗(yàn)分析dot-IBT、FEIA與SPT結(jié)果的一致性。結(jié)果 dot-IBT法測定變應(yīng)原靈敏度均較高，其中樹花粉、雜草花粉、真菌、塵螨和動(dòng)物毛靈敏度都在90.00%以上,特異度指標(biāo)中，雜草花粉、塵螨和動(dòng)物毛的特異度最好(>90.00%)，一致性分析中雜草花粉、塵螨和動(dòng)物毛一致性較高(Kappa系數(shù)>0.9)。FEIA法測定變應(yīng)原的特異度較高，樹花粉、雜草花粉、霉菌、動(dòng)物毛均在90.00%以上，靈敏度指標(biāo)中最好的是塵螨(100.00%)和動(dòng)物毛(100.00%)，一致性分析中顯示變應(yīng)原的一致性均較高(Kappa系數(shù)>0.6)。結(jié)論 dot-IBT總體靈敏度較高，快速，需要血清量少，可用于變應(yīng)原sIgE的篩查。FEIA法結(jié)果特異度較高，靈敏度尚可，有利于變應(yīng)原的確定。綜合dot-IBT、FEIA兩種方法sIgE的結(jié)果，并結(jié)合SPT及臨床過敏癥狀共同確定變應(yīng)原。

斑點(diǎn)免疫印跡法； 熒光酶聯(lián)免疫法； 特異度IgE； 皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)

變應(yīng)性鼻炎是接觸變應(yīng)原后，由Th2細(xì)胞介導(dǎo)的免疫炎癥。Th2細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素(IL)-4,IL-13,誘導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)炎癥的發(fā)生，并誘導(dǎo)產(chǎn)生IgE抗體[1]。診斷變應(yīng)性鼻炎的基礎(chǔ)是看是否有過敏，臨床懷疑變應(yīng)性鼻炎需要了解患者的變態(tài)反應(yīng)病史，而找到變應(yīng)原是確診變應(yīng)性鼻炎的有力證據(jù)[2]。變應(yīng)原檢測的皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)(SPT)是目前診斷變態(tài)反應(yīng)病中尋找變應(yīng)原推薦的試驗(yàn)，然而其常受藥物、皮膚劃痕癥等條件的限制[2]。體外血清學(xué)檢測特異度IgE(sIgE)不受身體等條件的限制彌補(bǔ)了SPT試驗(yàn)的不足，斑點(diǎn)免疫印跡法(dot-IBT)和熒光酶聯(lián)免疫法(FEIA)是目前體外檢測sIgE應(yīng)用較廣泛的兩種方法。FEIA法是自1989年生產(chǎn)以來因其較好的靈敏度和特異度，目前公認(rèn)為較可靠的IgE試驗(yàn)方法[3]，但其成本較高，需要血清量較大，使其臨床應(yīng)用受到較大限制。dot-IBT是近年來興起的具有簡單、快速、用血量較少的特點(diǎn)的sIgE試驗(yàn)，可同時(shí)測定多種變應(yīng)原組合，成本較低。但臨床試驗(yàn)中常發(fā)現(xiàn)sIgE結(jié)果與SPT結(jié)果不符的情況，為了解體外sIgE不同檢測方法與SPT結(jié)果的符合情況，本文比較了dot-IBT、FEIA分別與SPT結(jié)果的異同。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2012年3月至2013年8月北京大學(xué)第一醫(yī)院就診于耳鼻喉科確診的變應(yīng)性鼻炎患者37例，男18例，女19例，年齡4～70歲，中位年齡36歲。主訴有變應(yīng)性鼻炎病史或接觸變應(yīng)原后出現(xiàn)相關(guān)變態(tài)反應(yīng)病癥狀，皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)(SPT)或(和)特異度IgE陽性。

1.2 儀器與試劑 dot-IBT采用德國歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷股份公司的EURO Blot Master印跡法自動(dòng)操作儀以及特應(yīng)性變應(yīng)原 (中國組合)檢測試劑盒，佳能Canoscanline 100掃描判讀系統(tǒng)。

1.3 方法 SPT將變應(yīng)原液點(diǎn)于患者前臂屈側(cè)皮膚，持點(diǎn)刺針將針尖垂直點(diǎn)壓在液滴中，一液一針，不重復(fù)使用，破皮而不出血，且深度一致。SPT點(diǎn)刺20 min后觀察抗原的皮膚反應(yīng)。

dot-IBT：用dot-IBT法檢測5類血清變應(yīng)原sIgE，操作嚴(yán)格按試劑盒說明書步驟如下：(1)加樣。復(fù)融血清至室溫，充分混勻后加入血清150 μL至預(yù)先加有1.0 mL通用緩沖液及檢測膜條的溫育槽內(nèi)，搖床溫育16 h；(2)清洗。吸取溫育槽內(nèi)液體，用1.0 mL通用緩沖液清洗膜條3次，每次5 min；(3)加酶結(jié)合物。于各溫育槽加入1.0 mL酶結(jié)合物，搖床溫育60 min后重復(fù)上述清洗步驟1次；(4)加底物。每個(gè)溫育槽中加入底物1.0 mL，避光搖床溫育10 min后終止反應(yīng)；(5)取出檢測膜條自然風(fēng)干，采用專門軟件自動(dòng)判讀結(jié)果。

FEIA:Immuno-CAP系統(tǒng)使用纖維素固相載體，該固相載體是裝存小膠囊內(nèi)的親水性的多聚纖維素，經(jīng)溴化氧活化后與過敏原共價(jià)結(jié)合，過敏原預(yù)先結(jié)合在固相帽狀物的ImmunoCAP中，37 ℃孵育，如患者血清中有針對該變應(yīng)原的sIgE，即形成抗此變應(yīng)原抗體復(fù)合物，洗脫，加酶標(biāo)記的兔抗人IgE抗血清(酶標(biāo)二抗)，形成固相載體-變應(yīng)原-sIgE-酶標(biāo)二抗的結(jié)合物，再次洗脫，加入底物，產(chǎn)生酶催化熒光產(chǎn)物，終止液終止反應(yīng)；測定熒光值。根據(jù)熒光吸光度的大小換算成sIgE的含量。sIgE的定量結(jié)果以KU/L為單位。

1.4 結(jié)果判斷 SPT：變應(yīng)原風(fēng)團(tuán)反應(yīng)與陰性對照相同為陰性；變應(yīng)原分團(tuán)反應(yīng)范圍為標(biāo)準(zhǔn)組胺分團(tuán)反應(yīng)范圍的1/4為+；變應(yīng)原分團(tuán)反應(yīng)范圍為標(biāo)準(zhǔn)組胺分團(tuán)反應(yīng)范圍的1/2為++；變應(yīng)原分團(tuán)反應(yīng)范圍為標(biāo)準(zhǔn)組胺分團(tuán)反應(yīng)范圍為+++；變應(yīng)原分團(tuán)反應(yīng)范圍為標(biāo)準(zhǔn)組胺分團(tuán)反應(yīng)范圍的2倍為++++。

dot-IBT：結(jié)果用掃描儀收集數(shù)據(jù)后，由專用軟件根據(jù)條帶著色強(qiáng)度自動(dòng)判讀結(jié)果。條帶著色強(qiáng)度<3為陰性，著色強(qiáng)度≥3為陽性。

FEIA：檢測結(jié)果根據(jù)吸光度的大小換算成IgE結(jié)果。sIgE<0.35 KU/L為陰性， ≥0.35 KU/L為陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)錄入Excel中建立數(shù)據(jù)庫。以SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以SPT為比對方法，dot-IBT、FEIA與其進(jìn)行一致性檢驗(yàn)，Kappa系數(shù)≥0.6表示一致性較好,0.4

2 結(jié) 果

2.1 dot-IBT方法評價(jià) 以SPT為比對方法，評價(jià)dot-IBT與SPT測定結(jié)果的符合率見表1。

2.2 FEIA方法評價(jià) 以SPT為比對方法，評價(jià)EEIA與SPT測定結(jié)果的符合率見表2。

表1 dot-IBT法檢測變應(yīng)原sIgE的性能

表2 FEIA法檢測變應(yīng)原sIgE的性能

表3 變應(yīng)原不同方法ROC曲線下面積

2.3 變應(yīng)原不同方法ROC曲線下面積 各種類變應(yīng)原dot-IBT、FEIA法ROC曲線下面積結(jié)果見表3。

3 討 論

SPT檢測是將多種變應(yīng)原刺入皮膚，模擬變應(yīng)原接觸的過程，誘發(fā)Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生，是直接觀察機(jī)體對于變應(yīng)原的反應(yīng)，反映患者對變應(yīng)原的真實(shí)情況，但結(jié)果易受到操作者的技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)影響，且標(biāo)準(zhǔn)變應(yīng)原的含量和純度也會有所不同[2]。dot-IBT是根據(jù)某些固相載體具有較強(qiáng)吸附蛋白能力的特點(diǎn)建立起來的，是將經(jīng)分離的變應(yīng)原提取物吸附到膜條上作為固相。FEIA是將變應(yīng)原固定在親水性的多聚纖維素上，經(jīng)溴化氟活化后與變應(yīng)原共價(jià)結(jié)合。兩種方法的sIgE檢測結(jié)果不盡相同，王美玲等[4]對dot-IBT與FEIA兩種方法進(jìn)行了sIgE結(jié)果的比對，表明兩者之間具有良好的一致性。但與SPT結(jié)果是否一致需進(jìn)一步闡述。

本研究以變應(yīng)性鼻炎患者為研究對象，選取了吸入性變應(yīng)原中最常見的五類變應(yīng)原，根據(jù)dot-IBT與SPT結(jié)果比對得出，dot-IBT法測定變應(yīng)原靈敏度較高，五類吸入性變應(yīng)原靈敏度都在90.00%以上,特異度指標(biāo)中，雜草花粉、塵螨和動(dòng)物毛的特異度最好(>90.00%)，一致性分析中雜草花粉、塵螨和動(dòng)物毛一致性較高(Kappa系數(shù)>0.9)。加之dot-IBT實(shí)驗(yàn)使用小型儀器，也可手工操作，操作過程簡單，易于推廣和普及，因此，dot-IBT用于篩查試驗(yàn)結(jié)果較為理想。

FEIA法與SPT結(jié)果比對得出，F(xiàn)EIA法測定變應(yīng)原的特異度較高，樹花粉、雜草花粉、真菌、動(dòng)物毛均在90.00%以上，靈敏度指標(biāo)中最好的是塵螨(100.00%)和動(dòng)物毛(100.00%)，雜草花粉和霉菌的靈敏度較低，一致性分析中顯示變應(yīng)原的一致性均較高(Kappa系數(shù)>0.6)，總符合率高于dot-IBT。FEIA法中變應(yīng)原的特異度較高，可用于確診具體變應(yīng)原的種類，但是FEIA使用大型儀器，價(jià)格較昂貴，普通實(shí)驗(yàn)室推廣較為困難。

ROC曲線分析中顯示，F(xiàn)EIA法對于測定樹花粉、霉菌、動(dòng)物毛變應(yīng)原優(yōu)于dot-IBT法，雜草、塵螨兩種檢測方法dot-IBT法的ROC曲線下面積大于FEIA法，兩者曲線下面積均大于0.7，說明兩種方法檢測結(jié)果與SPT一致性均較好，然而兩種方法與SPT對于霉菌變應(yīng)原的測定均較其他組低，自然界中可引起變態(tài)反應(yīng)的霉菌變應(yīng)原種類繁多，空氣中大多為曲霉菌、鏈格菌、枝孢菌、念珠菌等，SPT霉菌變應(yīng)原提取物由多種霉菌組成，dot-IBT中霉菌變應(yīng)原中僅包括點(diǎn)青霉、分枝孢霉、煙曲霉菌和交鏈孢霉菌組成，而FEIA中霉菌變應(yīng)原組成包括青霉、多住分枝孢霉、煙曲霉、白色假絲酵母菌、交鏈孢霉、長蠕孢霉菌，均無SPT中所包含的霉菌類型多，由此可能會漏掉某些霉菌變應(yīng)原?？赡苁窃斐煞下实偷脑蛑唬黄涠赡苁怯捎谌梭w產(chǎn)生的抗交叉反應(yīng)性糖類決定簇(anti-CCDIgE)的影響，而抑制實(shí)驗(yàn)可提高變應(yīng)原的符合率[6]。

3種不同方法檢測變應(yīng)原中各類變應(yīng)原所包含的具體變應(yīng)原種類不盡相同，需要指出的是3種變應(yīng)原檢測方法所用的變應(yīng)原提取物有的為天然變應(yīng)原， 有的為重組變應(yīng)原[7-8]，有些是根據(jù)歐洲人群變應(yīng)原設(shè)計(jì)的，有些是本國特有的變應(yīng)原，并且同一類變應(yīng)原中的變應(yīng)原組分也不盡相同，提取制備的方法差別也較大[8-9]?，F(xiàn)在對變應(yīng)原主要組分研究相對成熟，是否可以制備標(biāo)準(zhǔn)化變應(yīng)原提取物，有待進(jìn)一步研究。

dot-IBT與FEIA檢測sIgE各有優(yōu)缺點(diǎn)。dot-IBT由于包被變應(yīng)原種類較多，可一次測定多種類型，總體靈敏度較高，可用于變應(yīng)原的篩查試驗(yàn)，快速、需要血清量少、成本適中。FEIA法則結(jié)果特異度較高、靈敏度尚可，可用于變應(yīng)原的確定，對具體變應(yīng)原種類有較好的指示作用。因此，對于變應(yīng)原的確定需結(jié)合SPT和血清sIgE結(jié)果綜合判斷，根據(jù)患者的情況先進(jìn)行SPT及血清dot-IBT法進(jìn)行篩選變應(yīng)原，再根據(jù)結(jié)果使用FEIA法進(jìn)行變應(yīng)原確診。

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Comparison of 3 kinds of method for performing allergen test in patients with allergic rhinitis

YANJinjin1,YUHao1,WANGMeiling2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,ShenzhenHospital,PekingUniversity,Shenzhen,Guangdong518000,China; 2.DepartmentofClinicalLaboratory,FirstHospital,PekingUniversity,Beijing100034,China)

Objective To compare and analyze the results of in vitro dot immunoblotting (dot-IBT), fluorescent enzyme-linked immunoassay (FEIA) and in vivo skin prick test (SPT) by dot-IBT and FEIA for detecting allergen specific IgE(sIgE) and SPT for detecting allergens in order to provide accurate and reliable sIgE experiment data for clinic.Methods The allergens in 37 patients with allergic rhinitis were detected by SPT and sIgE was detected by dot-IBT and FEIA. The specificity and sensitivity of dot-IBT and FEIA were analyzed, and their consistency with SPT was analyzed through the Kappa test.Results The sensitivity of dot-IBT for detecting allergens was higher, which for detecting tree pollen, weeds pollen, fungi, dust mites and animal hair was more than 90.00%;in specific indicators, weeds pollen, dust mites and animal hair had best specificity (>90.00%), in the consistency analysis, weeds pollen, dust mites and animal hair had higher consistency (Kappa>0.9). The specificity of FEIA for detecting allergens was higher, which for detecting tree pollen, weeds pollen, moulds and animal hair all were above 90.00%; in the sensitivity indexes, the best was the dust mites (100.00%) and animal hair (100.00%), the consistency analysis showed the consistency of allergens was higher(Kappa>0.6).Conclusion dot-IBT has higher overall sensitivity wit rapidness, needs less serum and can be used for the screening of allergen sIgE. The results of FEIA method has higher specificity, its sensitivity is general, which is helpful to determine the allergens. The allergens can be jointly determined by comprehensive sIgE results of dot-IBT and FEIA, and combining with SPT and clinical allergic symptoms.

dot immunoblotting; FEIA; specific IgE; skin prick test

閆津津，女，主管技師，主要從事免疫及微生物研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.24.017

A

1673-4130(2016)24-3429-03

2016-09-06

2016-10-25)