陳遠翔，向 軍

(重慶市萬州區(qū)婦幼保健院 404000)

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·個案與短篇·

陰道加德納菌的保存方法比較*

陳遠翔，向 軍

(重慶市萬州區(qū)婦幼保健院 404000)

陰道加德納菌； 保存方法; 比較

細菌性陰道病(BV)，也稱特異性陰道炎，臨床表現(xiàn)為婦女陰道分泌物增多、伴有典型的腥臭味、呈灰白色、均勻稀薄、黏度較低。陰道加德納菌(GV)是細菌性陰道病的重要致病菌之一[1-2]。GV感染可引起輸卵管異位妊娠、胎膜早破、產(chǎn)褥期感染、新生兒早產(chǎn)等不良妊娠結局[3-4]。最新報道GV能明顯刺激人類免疫缺陷病毒(HIV)在單核-巨噬系統(tǒng)T淋巴細胞中的表達，與HIV的傳播率增高有關[5]。菌種保存是分析該菌株流行病學、耐藥性變遷、醫(yī)院感染病原學調查的基礎，一般常用的菌種保存方法有多種[6-8]，如：冷凍干燥保存法、磁珠法、濾紙法、肉湯保存法等。本文采用3種不同方法保存陰道加德納菌，旨在為臨床篩選出操作簡便、實用、成本低廉的保存方法，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)基 共51株，其中50株為本院2014～2015年婦產(chǎn)科門診患者泌尿生殖道分泌物中的分離菌，1株為標準菌株(ATCC 14018)(上海寶錄生物公司代購，批號410-89-2)，人血哥比瓊脂培養(yǎng)基(自制)。

1.2 保存介質 濾紙(杭州富陽)，甘油(四川西隴化工)，脫脂奶粉(內蒙古伊利)。

1.3 儀器設備 -18 ℃冰箱(德國西門子)，-80 ℃冰箱(日本三洋)，CO2水套式恒溫箱(上海博訊)，生物安全柜(濟南鑫貝西)。

1.4 方法

1.4.1 標準菌株復蘇 標準菌種平衡至室溫后打開外包裝，捏碎菌種頂部內安瓶部分，使水化液流入含有菌種的底部，然后反復擠壓軟管底部促使細菌懸液分布均一。取出已經(jīng)浸透細菌懸液的拭子接種于人血哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基[9]，35 ℃，5% CO2孵育48 h。

1.4.2 濾紙保存法 將普通定性濾紙剪成2.5×0.8 cm條狀物高壓滅菌備用(121 ℃，15 min)，無菌操作濾紙刮取經(jīng)過5% CO2孵育48 h的菌株放入無菌EP管，用膠袋封口。

1.4.3 甘油保存法 EP管加入1 mL甘油高壓滅菌(121 ℃，15 min)，無菌操作濾紙刮取經(jīng)過5% CO2孵育48 h的菌株，放入已滅菌的無菌甘油EP管中，用膠袋封口。

1.4.4 牛奶保存法 10 g脫脂奶粉，0.5 g NaCl加入100 mL蒸餾水，攪拌溶解后每支EP管分裝1 mL高壓滅菌(121 ℃，15 min)，無菌操作濾紙刮取經(jīng)過5% CO2孵育48 h的菌株，放入已滅菌的無菌牛奶EP管中，用膠袋封口。

1.4.5 菌種保存 將上述3種方法制備好的菌株分別置于-18 ℃和-80 ℃冰箱保存。

1.4.6 陰道加德納菌復蘇 分別于1、2年將陰道加德納菌納菌接種于人血哥比瓊脂培養(yǎng)基，5% CO2孵育48 h后觀察。每株每種方法復蘇3支菌，計算平均存活率。

1.4.7 復蘇后菌種鑒定 法國梅里埃API-Coryne棒狀桿菌鑒定試劑盒。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析，計數(shù)資料以率表示，比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

陰道加德納菌按照不同方法分別置于-18 ℃和-80 ℃冰箱，回復至室溫后再取出接種。5% CO2孵育48 h，細菌生長情況見表1、2。

表1 陰道加德納菌3種保存方法(-18 ℃)

表2 陰道加德納菌3種保存方法(-80 ℃)

如表1所示：-18 ℃保存，牛奶保存法12、24個月存活率分別為100.0%和78.4%，甘油保存法分別為3.9%、0%，濾紙法均為0%。3種方法之間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表2顯示-80 ℃條件下，每種保存方法相對于-18 ℃存活率都有所提高，3種方法組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。由表1、2可知：在加入保護劑(甘油、牛奶)的保存環(huán)境比單獨只采用濾紙保存效果更好，-80 ℃比-18 ℃保存效果更好。經(jīng)統(tǒng)計學比較，-80 ℃牛奶保存法12、24個月存活率為100.0%、92.2%與其他兩種方法比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

復蘇后菌種采用法國梅里埃API-Coryne棒狀桿菌試劑盒鑒定，成功復蘇的菌種生化反應均沒有變化，與目標菌鑒定結果相符。

3 討 論

菌種保存的基本原理是挑選適宜的介質環(huán)境使其處于休眠狀態(tài)，降低新陳代謝速度，長期保存后仍能保持菌種原有的優(yōu)良特性?；敬胧旱蜏?、真空、干燥、加入保護劑。目前，國內大多數(shù)文獻所報道采用冷凍真空干燥法保存效果最好[10-11]。此法是將微生物在低溫中迅速冷凍，真空狀態(tài)下脫水干燥密封而成。但真空干燥設備價格昂貴，操作繁瑣，不適于醫(yī)院菌種保存工作中普遍開展。國內學者徐雅娟等[12]將牛奶保存法應用于金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌等29種臨床常見細菌保存，結果發(fā)現(xiàn)菌株保存36個月后顯示存活率100.0%。羅桂梅等[13]采用牛奶保存法保存85株淋球菌，2年內復活率97.7%。表明牛奶保存法不僅可以用于普通細菌的保存，同樣也可應用于苛養(yǎng)菌的保存。

陰道加德納菌屬苛養(yǎng)菌，營養(yǎng)要求高，在已有的文獻中沒有專門針對此菌的保存方法研究[14-15]。本文比較3種方法對陰道加德納菌的保存效果，結果發(fā)現(xiàn)：-80 ℃牛奶保存法12、24個月存活率分別為100.0%、92.2%，相比于其他方法，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。研究同時表明，低溫對于陰道加德納菌保存有明顯延長作用，其中甘油法-80 ℃，12個月存活率(84.0%)明顯高于同期-18 ℃存活率(3.9%)。

本研究表明，將牛奶保存法應用于陰道加德納菌的保存是可行的。-80 ℃牛奶保存12個月、24個月存活率分別為100.0%、92.2%。陰道加德納菌牛奶保存法具有操作簡便、成本低廉等特點，值得推廣應用。

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重慶市萬州區(qū)科技項目(201403045)。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.24.061

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1673-4130(2016)24-3521-02

2016-07-12

2016-09-28)