田 華， 馬守原， 康攀攀， 郝 奇， 焦 鵬， 邵夏炎， 徐曉燕， 秦樹存△， 姚樹桐,△

(泰山醫(yī)學(xué)院 1動脈粥樣硬化研究所，山東省高校動脈粥樣硬化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271000；3中國人民解放軍總醫(yī)院南樓心血管內(nèi)科，北京 100853；4承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北 承德 067000；5泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 泰安 271000)

自噬通過抑制C/EBP同源蛋白表達(dá)減輕氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡*

田 華1,2▲， 馬守原3▲， 康攀攀4， 郝 奇2， 焦 鵬1， 邵夏炎2， 徐曉燕5， 秦樹存1△， 姚樹桐1,2△

(泰山醫(yī)學(xué)院1動脈粥樣硬化研究所，山東省高校動脈粥樣硬化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271000；3中國人民解放軍總醫(yī)院南樓心血管內(nèi)科，北京 100853；4承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北 承德 067000；5泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 泰安 271000)

目的： 研究自噬對氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)所致巨噬細(xì)胞凋亡的影響，并探討可能的分子機(jī)制。方法:體外培養(yǎng)RAW264.7巨噬細(xì)胞，分別給予3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA； 3 mmol/L)、雷帕霉素(rapamycin，Rap; 1 μmol/L)或4-苯丁酸(4-phenylbutyric acid，PBA; 4 mmol/L)預(yù)處理1 h，再加入ox-LDL(100 mg/L)繼續(xù)培養(yǎng)12 h。分別采用MTT法和Annexin V-FITC雙染法檢測細(xì)胞活力和凋亡情況；相應(yīng)試劑盒測定培養(yǎng)液乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)和細(xì)胞內(nèi)caspase-3活性；采用Western blot法檢測自噬標(biāo)志分子beclin-1和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)及促凋亡蛋白C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)表達(dá)的變化;采用激光共聚焦顯微鏡觀測細(xì)胞內(nèi)微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)的變化。結(jié)果:ox-LDL處理可顯著降低巨噬細(xì)胞活力，并增加LDH漏出、凋亡率及caspase-3活性；ox-LDL對細(xì)胞的上述損傷作用可被自噬抑制劑3-MA促進(jìn)而被自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素拮抗。ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬反應(yīng)，表現(xiàn)為beclin-1表達(dá)上調(diào)，LC3顆?；@著；ox-LDL對自噬的誘導(dǎo)作用可被3-MA抑制而被Rap增強(qiáng)。另外，3-MA可促進(jìn)ox-LDL所誘導(dǎo)的CHOP進(jìn)一步上調(diào)，而Rap可明顯拮抗ox-LDL對CHOP的誘導(dǎo)作用。PBA可顯著抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的GRP78上調(diào)，且明顯減輕ox-LDL所誘導(dǎo)的自噬反應(yīng)，表現(xiàn)為beclin-1表達(dá)下調(diào)，LC3顆?；潭葴p弱。結(jié)論:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)ox-LDL對巨噬細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)作用，而一定程度的自噬可通過抑制CHOP表達(dá)從而減輕ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡。

自噬； 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激； 氧化低密度脂蛋白； 巨噬細(xì)胞； 細(xì)胞凋亡

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)作為心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，嚴(yán)重危害人類的健康。在AS發(fā)生發(fā)展尤其晚期粥樣硬化斑塊破裂過程中，巨噬源性泡沫細(xì)胞凋亡起到至關(guān)重要的作用，一方面可直接導(dǎo)致凋亡的平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞不能被有效吞噬，促進(jìn)脂質(zhì)核心的形成及增大，另一方面富含游離膽固醇的凋亡巨噬細(xì)胞通過釋放基質(zhì)降解蛋白酶損傷纖維帽，并產(chǎn)生白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α等炎癥因子，引起繼發(fā)性炎癥反應(yīng)和壞死，從而促進(jìn)斑塊不穩(wěn)定[1]。因此，巨噬細(xì)胞已被認(rèn)為是AS防治、降低急性心血管事件發(fā)生率的重要干預(yù)靶點(diǎn)[2]，而進(jìn)一步闡明巨噬細(xì)胞凋亡機(jī)制及其影響因素?zé)o疑具有重要意義。文獻(xiàn)報道[3-4]和本課題組既往研究[5-6]表明，C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)凋亡途徑在巨噬細(xì)胞凋亡和易損斑塊形成中具有重要作用，而載脂蛋白A1模擬肽D4F和蜂膠醇提物可通過抑制CHOP表達(dá)減輕氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡。

自噬是細(xì)胞將受損、變性的蛋白質(zhì)以及損傷細(xì)胞器運(yùn)輸?shù)饺苊阁w進(jìn)行消化降解，以胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)自噬體為特征的細(xì)胞自我消化過程，是細(xì)胞在應(yīng)激情況下用來維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和存活的一種重要防御機(jī)制[7]。近年來研究表明，AS斑塊中存在巨噬細(xì)胞自噬，且自噬的激活可減輕AS病變，增強(qiáng)斑塊的穩(wěn)定性[8]，但其機(jī)制尚未完全闡明。新近研究報道ERS誘導(dǎo)劑衣霉素可通過誘導(dǎo)自噬反應(yīng)增強(qiáng)AS斑塊的穩(wěn)定性[9]，提示ERS與自噬可能存在交互作用，并參與AS的發(fā)生發(fā)展；而本課題組既往研究[10]表明，ox-LDL可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬，且一定程度的自噬可減輕ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞損傷，但其機(jī)制尚不清楚。本工作在ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞損傷模型上，研究自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)和誘導(dǎo)劑雷帕霉素(rapamycin，Rap)對ox-LDL所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及CHOP表達(dá)的影響，并觀察ERS抑制劑4-苯丁酸(4-phenylbutyric acid，PBA)對ox-LDL所致自噬反應(yīng)的影響，以探討ERS與自噬在巨噬細(xì)胞凋亡中的交互作用。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

ox-LDL購自北京協(xié)生生物科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco； RIPA裂解液和BCA蛋白定量試劑盒為Solarbio產(chǎn)品；兔抗葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)、CHOP、beclin-1和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3)多克隆抗體分別購自Santa Cruz和Cell Signaling Technology；Rap、3-MA、PBA和兔抗β-actin抗體購自Sigma；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG和Alexa Fluor 488標(biāo)記驢抗兔 II 抗分別購自北京中杉金橋和Molecular Probes；四甲基偶氮唑藍(lán)[3-(4,5-dimeth-ylthiazol-2-y-l)-2,5-diphenyl-2H- tetrazolium bromide，MTT]和Annexin V-FITC凋亡測定試劑盒分別購自Genview和南京凱基公司；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒和PVDF膜分別為Pierce和Millipore產(chǎn)品；Caspase-3和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性測定試劑盒分別購自碧云天生物和南京建成生物技術(shù)公司；其余試劑均為分析純產(chǎn)品。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組 鼠源RAW264.7巨噬細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫，用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。處理前換無血清培養(yǎng)基同步化12 h，然后隨機(jī)分為如下5組：正常對照(control)組：培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)；ox-LDL組：培養(yǎng)液中加入100 mg/L ox-LDL；自噬抑制劑3-MA預(yù)處理組(ox-LDL+3-MA組)：培養(yǎng)液中先加入3 mmol/L 3-MA預(yù)處理1 h，再加入100 mg/L ox-LDL；自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素預(yù)處理組(ox-LDL+Rap組)：培養(yǎng)液中先加入1 μmol/L Rap預(yù)處理1 h，再加入100 mg/L ox-LDL；ERS抑制劑PBA預(yù)處理組(ox-LDL+PBA組)：培養(yǎng)液中先加入4 mmol/L PBA預(yù)處理1 h，再加入100 mg/L ox-LDL。培養(yǎng) 12 h 收集細(xì)胞。

2.2 細(xì)胞活力和LDH的測定 接種于96孔板的細(xì)胞經(jīng)處理后，按既往報道的MTT分析方法[11]檢測細(xì)胞活力。以正常對照組細(xì)胞活力為100%，其余各組細(xì)胞活力以其吸光度(A)值占對照組A值的百分比表示。按照LDH活性檢測試劑盒說明書測定培養(yǎng)上清中LDH活性。

2.3 Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞經(jīng)處理后，收集并重懸于500 μL上樣緩沖液中，與5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)室溫避光孵育15 min。細(xì)胞凋亡率由流式細(xì)胞儀(Becton-Dickinson)分析測定。總細(xì)胞凋亡率(%)=早期凋亡率(Annexin+/PI-)+晚期凋亡率(Annexin+/PI+)。

2.4 細(xì)胞內(nèi)caspase-3活性的測定 按照試劑盒說明書操作，即細(xì)胞經(jīng)處理后，收集并用PBS洗滌1次，以裂解液冰浴裂解15 min，4 ℃條件下18 000×g離心15 mim，采用Bradford法檢測上清液中蛋白濃度。在96孔板中將10 μL裂解上清液、80 μL反應(yīng)緩沖液和10 μL caspase-3底物混合并在37 ℃條件下孵育2 h。在多功能酶標(biāo)儀(Tecan)上于405 nm處讀取吸光度，通過相同條件下獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中caspase-3活性，并以正常對照組細(xì)胞caspase-3活性為100%，其余各組細(xì)胞caspase-3活性以其占正常對照組的百分比表示。

2.5 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測LC3的表達(dá) 將細(xì)胞培養(yǎng)于放有無菌蓋玻片的6孔培養(yǎng)板內(nèi)，細(xì)胞經(jīng)處理后， PBS潤洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS潤洗后以0.1% Triton X-100室溫處理4 min，10%驢血清封閉，滴加1∶100比例稀釋的兔抗小鼠LC3的 I 抗，4 ℃過夜后滴加Alexa Fluor 488標(biāo)記驢抗兔 II 抗(1∶1 000)，37 ℃孵育30 min，并以DAPI復(fù)染細(xì)胞核(藍(lán)色)，PBS充分潤洗后以抗淬滅劑封片。激光共聚焦顯微鏡 (Nikon)下觀察，LC3陽性表達(dá)呈綠色，呈顆粒狀聚集表明發(fā)生自噬反應(yīng)。

2.6 Western blot分析 細(xì)胞經(jīng)處理后，按照RIPA蛋白提取試劑盒說明書提取各組細(xì)胞蛋白，經(jīng)定量、變性處理并進(jìn)行SDS-PAGE(8%～10%分離膠)后電轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉后，分別用兔抗beclin-1 (1∶800)、CHOP (1∶500)、GRP78 (1∶400)和β-actin抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，洗膜后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng) II 抗孵育2 h。免疫條帶用ECL法顯示，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海歐翔科學(xué)儀器有限公司)進(jìn)行圖像采集，采用Image-Pro Plus軟件分析蛋白條帶累積吸光度(integrated absorbance，IA)值，以靶蛋白IA值/β-actinIA值的比值反映靶蛋白相對水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間兩兩比較應(yīng)用SNK法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 3-MA和雷帕霉素對ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活力的影響

分別采用MTT法和LDH活性檢測試劑盒測定巨噬細(xì)胞活力和LDH漏出情況，結(jié)果顯示，以100 mg/L ox-LDL處理RAW264.7細(xì)胞12 h可明顯造成細(xì)胞損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞活力降低和LDH漏出增加(P<0.01)；ox-LDL對巨噬細(xì)胞的上述損傷作用可被自噬抑制劑3-MA進(jìn)一步加重，但可被自噬誘導(dǎo)劑Rap所拮抗，與ox-LDL處理組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，表明自噬可減輕ox-LDL所誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷,見圖1。

2 3-MA和雷帕霉素對ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡的影響

Annexin V-FITC/PI雙染色法結(jié)果顯示，ox-LDL處理組細(xì)胞凋亡率明顯增加，為正常對照組的3.59倍(P<0.01)；與ox-LDL處理組比較，3-MA預(yù)處理組細(xì)胞凋亡率增加72.1%(P<0.01)，而Rap預(yù)處理組細(xì)胞凋亡率下降37.0%(P<0.05)。

Figure 1.The effect of 3-MA and Rap on the cell viability of RAW264.7 macrophages induced by ox-LDL. The cells were pretreated with or without 3-MA (3 mmol/L) or Rap (1 μmol/L) for 1 h and then stimulated with ox-LDL (100 mg/L) for 12 h. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsox-LDL group.

圖1 3-MA和雷帕霉素對ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活力的影響

Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵蛋白酶，檢測其活性變化可進(jìn)一步證實(shí)自噬對ox-LDL所致細(xì)胞凋亡的影響。3-MA可進(jìn)一步促進(jìn)ox-LDL所誘導(dǎo)的caspase-3活性,而Rap則拮抗ox-LDL對caspase-3的誘導(dǎo)作用(P<0.05)，表明自噬可減輕ox-LDL所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，見圖2。

3 3-MA和雷帕霉素對ox-LDL所誘導(dǎo)的CHOP表達(dá)的影響

Beclin-1是自噬啟動的關(guān)鍵分子；自噬發(fā)生后，LC3-I經(jīng)泛素樣加工修飾形成 LC3-II，進(jìn)而整合到自噬體膜中，在自噬體形成中起重要作用，因此beclin-1和LC3可作為自噬的標(biāo)志分子。分別采用Western blot(圖3)和免疫細(xì)胞化學(xué)法(圖4)檢測beclin-1表達(dá)和LC3聚集情況，結(jié)果顯示，與正常對照組比較，以ox-LDL處理RAW264.7細(xì)胞 12 h，beclin-1表達(dá)水平明顯增加(P<0.01)，LC3顆?；憩F(xiàn)顯著，表明ox-LDL可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬；ox-LDL的上述作用可被3-MA抑制(P<0.05); Rap可稍增加ox-LDL誘導(dǎo)的beclin-1的表達(dá)，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以3-MA抑制巨噬細(xì)胞自噬后，ox-LDL所誘導(dǎo)的CHOP進(jìn)一步上調(diào)(P<0.05)，而Rap可明顯拮抗ox-LDL對CHOP的誘導(dǎo)作用(P<0.05)，表明一定程度的自噬可減輕ox-LDL對CHOP的誘導(dǎo)作用。

Figure 2.The effect of 3-MA and Rap on the apoptosis of RAW264.7 macrophages induced by ox-LDL. A: the cell apoptosis was detected by flow cytometry and the total apoptotic cells (early-and late-stage apoptosis) were represented by the right side of the panel (Annexin V staining alone or together with PI); B: the caspase-3 activity was determined by colorimetric assay. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsox-LDL group.

圖2 3-MA和雷帕霉素對ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡的影響

4 PBA對ox-LDL所誘導(dǎo)的自噬反應(yīng)的影響

為了進(jìn)一步證明ERS是否可介導(dǎo)ox-LDL對巨噬細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)作用，課題組又探討了ERS抑制劑PBA對ox-LDL所致RAW264.7細(xì)胞自噬的影響，結(jié)果顯示，PBA可顯著抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的ERS標(biāo)志分子GRP78表達(dá)(P<0.01)，且明顯減輕ox-LDL所誘導(dǎo)的自噬反應(yīng)，表現(xiàn)為beclin-1表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，LC3顆?；潭葴p弱，見圖5、6。

Figure 3.The effect of 3-MA and Rap on the expression of beclin-1 and CHOP in RAW264.7 macrophages. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsox-LDL group.

圖3 3-MA和雷帕霉素對巨噬細(xì)胞beclin-1和CHOP表達(dá)的影響

Figure 5.The effect of PBA on the expression of GRP78 and beclin-1 in the RAW264.7 macrophages. The cells were pretreated with or without PBA (4 mmol/L) for 1 h and then stimulated with ox-LDL (100 mg/L) for 12 h. The protein levels of GRP78 and beclin-1 were evaluated by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsox-LDL group.

圖5 PBA對巨噬細(xì)胞GRP78和beclin-1表達(dá)的影響

Figure 4.The effect of 3-MA and Rap on the expression of LC3 in RAW264.7 macrophages. The cells were treated as described in figure 1 and then immunofluorescence experiment showed LC3 visualized by Alexa Fluor 488 (green) and nuclei stained with DAPI (blue). The representative fluorescent images captured using a laser scanning confocal microscope were showed.

圖4 3-MA和雷帕霉素對巨噬細(xì)胞LC3表達(dá)的影響

Figure 6.The effect of PBA on the expression of LC3 in RAW264.7 macrophages. The cells were treated as described in figure 5 and then immunofluorescence experiment showed LC3 visualized by Alexa Fluor 488 (green) and nuclei stained with DAPI (blue). The representative fluorescent images captured using a laser scanning confocal microscope were showed.

圖6 PBA對巨噬細(xì)胞LC3表達(dá)的影響

討 論

自噬是指細(xì)胞受到饑餓、氧化應(yīng)激等因素刺激后在自噬相關(guān)基因(autophagy-associated gene，ATG)的調(diào)控下，利用溶酶體降解錯誤折疊、受損、衰老蛋白及細(xì)胞器進(jìn)而再利用的過程，該過程以包繞胞漿成分的具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體為主要特征。近年來研究表明，自噬與AS密切相關(guān)，廣泛發(fā)生于AS發(fā)生發(fā)展中的血管內(nèi)皮、平滑肌及巨噬細(xì)胞，并參與其生物活性的調(diào)控[7, 12]。研究報道，在粥樣硬化斑塊中存在自噬反應(yīng)[8]，ox-LDL及其主要氧化成分7-酮膽甾醇(7-ketocholesterol，7-KC)可誘導(dǎo)血管平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞自噬，而自噬缺陷或自噬抑制劑3-MA可加重ox-LDL、7-KC所致的血管平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞損傷[13-14]。另有文獻(xiàn)報道介導(dǎo)自噬過程的關(guān)鍵蛋白ATG5缺陷可增加粥樣硬化斑塊中巨噬細(xì)胞凋亡，促進(jìn)斑塊壞死，而給予雷帕霉素誘導(dǎo)自噬則降低斑塊的易損性[8, 14]，提示自噬作為一種細(xì)胞自穩(wěn)態(tài)調(diào)控機(jī)制，可能對AS進(jìn)展具有延緩作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，自噬抑制劑3-MA加重了ox-LDL所誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞活力降低，LDH漏出、細(xì)胞凋亡率及caspase-3活性進(jìn)一步增加；而自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素則可減輕ox-LDL所誘導(dǎo)的上述細(xì)胞損傷，表明一定程度的自噬可減輕ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡。

大量研究表明ERS介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡與AS 斑塊形成和破裂密切相關(guān)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)蛋白合成、折疊、修飾和運(yùn)輸以及鈣穩(wěn)態(tài)的重要細(xì)胞器。氧化應(yīng)激、膽固醇超負(fù)荷、高血糖等多種因素均可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，出現(xiàn)以未折疊/錯誤折疊蛋白聚集和鈣穩(wěn)態(tài)失衡為主要特征的ERS反應(yīng)[15]。一定程度的ERS通過暫時性抑制蛋白合成、上調(diào)GRP78等分子伴侶和激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解途徑，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能和細(xì)胞生存。但是過強(qiáng)或過久的ERS則會誘發(fā)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致不可逆損傷，其中由CHOP介導(dǎo)的ERS凋亡途徑在巨噬細(xì)胞凋亡尤其是晚期不穩(wěn)定粥樣斑塊形成中的作用已被大量研究證實(shí)[3, 4, 16]。而且我們前期工作已證實(shí)ERS-CHOP信號途徑介導(dǎo)ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡，而D4F和蜂膠黃酮及其單體槲皮素通過抑制該信號途徑減輕ox-LDL對巨噬細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用[5-6, 17-18]。He等[14]報道7-KC可通過氧化應(yīng)激觸發(fā)人動脈平滑肌細(xì)胞ERS和自噬的發(fā)生，而3-MA抑制自噬則加重7-KC所誘導(dǎo)的ERS反應(yīng)和細(xì)胞死亡，雷帕霉素誘導(dǎo)自噬則減輕7-KC的上述作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ox-LDL對CHOP的誘導(dǎo)作用被3-MA進(jìn)一步上調(diào)，而被雷帕霉素所拮抗，提示一定程度的自噬可能通過抑制ox-LDL對CHOP的上調(diào)作用減輕巨噬細(xì)胞凋亡。

ERS時產(chǎn)生的大多數(shù)可溶性未折疊或錯誤折疊蛋白優(yōu)先通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解途徑(ER-associated degradation，ERAD)降解。然而當(dāng)未折疊或錯誤折疊蛋白過多超出ERAD的清除能力或ERAD功能受損時，將會形成聚泛素化、穩(wěn)定難溶且對蛋白酶體功能有一定毒性的蛋白聚集物，此時可通過激活自噬清除這些有毒聚集物，因此,ERS是激活自噬反應(yīng)的重要因素，且與自噬存在交互作用[19]。Ma等[9]報道ERS誘導(dǎo)劑衣霉素可通過誘導(dǎo)自噬反應(yīng)增強(qiáng)粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ERS抑制劑PBA可明顯減輕ox-LDL所誘導(dǎo)的自噬反應(yīng)，提示ERS介導(dǎo)ox-LDL對巨噬細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)作用。

綜上所述，ERS介導(dǎo)ox-LDL對巨噬細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)作用，而一定程度的自噬可通過抑制CHOP的表達(dá)減輕ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡。

[1] Moore KJ, Tabas I. Macrophages in the pathogenesis of atherosclerosis[J]. Cell, 2011, 145(3):341-355.

[2] Williams HJ, Fisher EA, Greaves DR. Macrophage differentiation and function in atherosclerosis: opportunities for therapeutic intervention?[J]. J Innate Immun, 2012, 4(5-6):498-508.

[3] Yu X, Wang Y, Zhao W, et al. Toll-like receptor 7 promotes the apoptosis of THP-1-derived macrophages through the CHOP-dependent pathway[J]. Int J Mol Med, 2014, 34(3):886-893.

[4] Thorp E, Li G, Seimon TA, et al. Reduced apoptosis and plaque necrosis in advanced atherosclerotic lesions of Apoe-/-and Ldlr-/-mice lacking CHOP[J]. Cell Metab, 2009, 9(5):474-481.

[5] Yao S, Tian H, Miao C, et al. D4F alleviates macrophage-derived foam cell apoptosis by inhibiting CD36 expression and ER stress-CHOP pathway[J]. J Lipid Res, 2015, 56(4):836-847.

[6] Tian H, Sun HW, Zhang JJ, et al. Ethanol extract of propolis protects macrophages from oxidized low density lipoprotein-induced apoptosis by inhibiting CD36 expression and endoplasmic reticulum stress-C/EBP homologous protein pathway[J]. BMC Complement Altern Med, 2015, 15: 230-241.

[7] Mei Y, Thompson MD, Cohen RA, et al. Autophagy and oxidative stress in cardiovascular diseases[J]. Biochim Biophys Acta, 2015, 1852(2):243-251.

[8] Liao X, Sluimer JC, Wang Y, et al. Macrophage autophagy plays a protective role in advanced atherosclerosis[J]. Cell Metab, 2012, 15(4):545-553.

[9] Ma M, Song L, Yan H, et al. Low dose tunicamycin enhances atherosclerotic plaquestability by inducing autophagy[J]. Biochem Pharmacol, 2016, 100: 51-60.

[10]姚樹桐，李嚴(yán)嚴(yán)，劉慶華，等. 氧化低密度脂蛋白通過CD36介導(dǎo)的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31( 6):1002-1007.

[11]李嚴(yán)嚴(yán)，徐曉燕，張家君，等. 蜂膠醇提物通過抑制caspase-12減輕氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(12): 2202-2208.

[12]郭鳳霞，危當(dāng)恒. 自噬與動脈粥樣硬化[J]. 生命的化學(xué), 2013, 33(4): 461-465.

[13]張艷林，曹勇軍，尤壽江，等. 自噬對氧化低密度脂蛋白損傷內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2010, 90(39):2792-2796.

[14]He C, Zhu H, Zhang W, et al. 7-Ketocholesterol induces autophagy in vascular smooth muscle cells through Nox4 and Atg4B[J]. Am J Pathol, 2013, 183(2): 626-637.

[15]姚樹桐，秦樹存. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展和防治中的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(2):364-368.

[16]Tsukano H, Gotoh T, Endo M, et al. The endoplasmic reticulum stress-C/EBP homologous protein pathway-mediated apoptosis in macrophages contributes to the instability of atherosclerotic plaques[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2010, 30(10):1925-1932.

[17]Yao S, Zong C, Zhang Y, et al. Activating transcription factor 6 mediates oxidized LDL-induced cholesterol accumulation and apoptosis in macrophages by up-regulating CHOP expression[J]. J Atheroscler Thromb, 2013, 20(1): 94-107.

[18]Yao S, Sang H, Song G, et al. Quercetin protects macrophages from oxidized low-density lipoprotein-induced apoptosis by inhibiting the endoplasmic reticulum stress-C/EBP homologous protein pathway[J]. Exp Biol Med, 2012, 237(7): 822-831.

[19]H?yer-Hansen M, J??ttel? M. Connecting endoplasmic reticulum stress to autophagy by unfolded protein response and calcium[J]. Cell Death Differ, 2007, 14(9): 1576-1582.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Autophagy protects macrophages from oxidized low-density lipoprotein-induced apoptosis by inhibiting C/EBP homologous protein expression

TIAN Hua1, 2, MA Shou-yuan3, KANG Pan-pan4, HAO Qi2, JIAO Peng1, SHAO Xia-yan2, XU Xiao-yan5, QIN Shu-cun1, YAO Shu-tong1, 2

(1InstituteofAtherosclerosis,KeyLaboratoryofAtherosclerosisinUniversitiesofShandong,2CollegeofBasicMedicalSciences,TaishanMedicalUniversity,Taian271000,China;3DepartmentofCardiovascularMedicineinSouthBuilding,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing100853,China;4AffiliatedHospitalofChengdeMedicalUniversity,Chengde067000,China;5CollegeofPharmacy,TaishanMedicalUniversity,Taian271000,China.E-mail:shucunqin@hotmail.com;yst228@126.com)

AIM: To investigate the protective effect of autophagy on oxidized low density lipoprotein (ox-LDL)-induced macrophage apoptosis and the underlying molecular mechanisms. METHODS: The RAW264.7 macrophages were pretreated with 3 mmol/L 3-methyladenine (3-MA), 1 μmol/L rapamycin (Rap) or 4 mmol/L 4-phenylbutyric acid (PBA) respectively for 1 h and then treated with ox-LDL (100 mg/L) for 12 h. The cell viability and apoptosis were determined by MTT assay and flow cytometry with Annexin V-FITC/ PI staining, respectively. The activities of lactate dehydrogenase (LDH) in the medium and caspase-3 in the cells were determined by detection kits. The protein levels of beclin-1 (a molecular marker of autophagy), glucose-regulated protein 78 (GRP78, an endoplasmic reticulum stress marker) and C/EBP homologous protein (CHOP, a key-signaling component of endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis) were examined by Western blot. Microtubule-associated protein 1 light chain 3 (LC3, another molecular marker of autophagy) was observed under laser scanning confocal microscope.RESULTS: Treatment of the RAW264.7 macrophages with ox-LDL at 100 mg/L for 12 h resulted in significant decrease in cell viability, and dramatic elevation in LDH leakage, cell apoptosis and caspase-3 activity, which were promoted by 3-MA (an autophagy inhibitor) and inhibited by Rap (an autophagy inducer). ox-LDL induced autophagy in the macrophages as assessed by beclin-1 upregulation and frequent granulation of LC3, which were inhibited by 3-MA and promoted by Rap. Interestingly, 3-MA enhanced, while Rap blocked, the CHOP upregulation induced by ox-LDL. Moreover, PBA (endoplasmic reticulum stress inhibitor) significantly inhibited ox-LDL-induced GRP78 upregulation and autophagy as determined by the attenuation of beclin-1 upregulation and frequent granulation of LC3. CONCLUSION: Endoplasmic reticulum stress mediates ox-LDL-induced autophagy in macrophages, and moderates activation of autophagy may protect macrophages from ox-LDL-induced apoptosis by inhibiting CHOP expression.

Autophagy; Endoplasmic reticulum stress; Oxidized low density lipoprotein; Macrophage; Apoptosis

1000- 4718(2016)12- 2192- 07

2016- 07- 04

2016- 09- 13

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81570410； No. 81370381)；國家級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(No. 201510439126； No. 201510439100)

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.12.011

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 秦樹存 Tel： 0538-6237252； E-mail: shucunqin@hotmail.com； 姚樹桐 Tel： 0538-6225010; E-mail: yst228@126.com

▲并列第1作者