侯婧瑛， 周長青， 鄭韶欣， 郭天柱， 龍會(huì)寶， 伍權(quán)華， 鐘婷婷， 吳 浩， 汪 蕾， 王 彤△

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院 1急診科， 2心內(nèi)科， 廣東 廣州 510120)

用雙螢光素酶報(bào)告基因技術(shù)驗(yàn)證小鼠lncRNA-H19與miR-199a-5p的靶向關(guān)系*

侯婧瑛1， 周長青1， 鄭韶欣2， 郭天柱1， 龍會(huì)寶1， 伍權(quán)華1， 鐘婷婷1， 吳 浩1， 汪 蕾1， 王 彤1△

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院1急診科，2心內(nèi)科， 廣東 廣州 510120)

目的： 構(gòu)建長鏈非編碼RNA-H19(lncRNA-H19)螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒，利用雙螢光素酶報(bào)告基因技術(shù)驗(yàn)證小鼠lncRNA-H19與微小RNA-199a-5p(miR-199a-5p)的靶向關(guān)系。方法:通過生物信息學(xué)網(wǎng)站RegRNA 2.0預(yù)測(cè)獲取小鼠lncRNA-H19 與miR-199a-5p潛在的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。將H19及其突變體克隆到螢光素酶載體psiCHECK-2中，構(gòu)建H19 野生型和突變型質(zhì)粒，并采用酶切和測(cè)序方法鑒定psiCHECK-2-H19 載體是否構(gòu)建成功。將H19 野生型和突變型質(zhì)粒分別與miR-199a-5p模擬物、miR-199a-5p抑制劑、miR-199a-5p模擬物陰性對(duì)照或miR-199a-5p 抑制劑陰性對(duì)照在293T 細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染。收集細(xì)胞后通過雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)不同組別的螢光素酶活性，從而對(duì)lncRNA-H19 與miR-199a-5p的靶向調(diào)節(jié)關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果:構(gòu)建的重組螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定正確，雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示，與miR-199a-5p模擬物陰性對(duì)照組相比，miR-199a-5p模擬物組H19野生型報(bào)告基因的螢光素酶活性顯著降低，下降約49%左右(P<0.01)，而miR-199a-5p 抑制劑組H19 野生型報(bào)告基因的螢光素酶活性較miR-199a-5p模擬物組明顯增高(P<0.01)。miR-199a-5p模擬物、miR-199a-5p抑制劑、miR-199a-5p模擬物陰性對(duì)照以及miR-199a-5p 抑制劑陰性對(duì)照對(duì)H19突變型的螢光素酶活性均無明顯影響。結(jié)論:lncRNA-H19能夠靶向結(jié)合miR-199a-5p，并在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)其有直接抑制作用。

長鏈非編碼RNA-H19； 微小RNA-199a-5p； 雙螢光素酶報(bào)告基因

非編碼RNA在蛋白表達(dá)中具有重要調(diào)控作用。長鏈非編碼RNA (long noncoding RNA, lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200個(gè)核苷酸的功能性RNA分子，其能夠從不同層面實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用[1]。微小RNA (microRNA， miRNA)是一類長約22個(gè)核苷酸分子的內(nèi)源性非編碼RNA，通過與靶基因3’端非翻譯區(qū)(untranslated region, UTR)的不完全結(jié)合而發(fā)揮對(duì)基因表達(dá)的負(fù)向調(diào)節(jié)[2]?，F(xiàn)有的證據(jù)表明lncRNA可通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則競爭性結(jié)合miRNA從而抑制miRNA對(duì)靶基因表達(dá)的調(diào)控[3-4]。在本研究中，我們通過生物信息學(xué)網(wǎng)站RegRNA 2.0數(shù)據(jù)庫進(jìn)行預(yù)測(cè)獲取小鼠lncRNA-H19 與miR-199a-5p潛在的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步構(gòu)建含小鼠lncRNA-H19序列的野生型和突變型質(zhì)粒的雙螢光素酶報(bào)告基因載體，并采用雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)驗(yàn)證小鼠lncRNA-H19與miR-199a-5p之間的靶向關(guān)系。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞系和試劑

DMEM 高糖培養(yǎng)液、胎牛血清(fetal bovine se-rum，F(xiàn)BS)和胰蛋白酶均購自HyClone；miR-199a-5p模擬物、抑制劑及相應(yīng)對(duì)照序列(廣州銳博生物科技有限公司)；psiCHECK-2 雙螢光素酶報(bào)告基因載體、螢光素酶檢測(cè)試劑盒和雙螢光素酶基因報(bào)告分析系統(tǒng)(Promega)；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 (Invitrogen)；293T 細(xì)胞(中國科學(xué)院細(xì)胞庫)。

2 細(xì)胞培養(yǎng)

293T細(xì)胞使用含10% FBS 的DMEM (含4.0 mmol/L 谷氨酰胺、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長成均勻單層細(xì)胞并達(dá)90%以上聚集度時(shí)傳代，將培養(yǎng)基吸出加入500μL 0.25%胰蛋白酶室溫下短暫消化，于顯微鏡下觀察當(dāng)細(xì)胞皺縮變圓時(shí)立即加入DMEM培養(yǎng)基，反復(fù)吹打成細(xì)胞懸液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以含10% FBS的DMEM調(diào)整細(xì)胞密度后重新接種于10 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿，每皿5×106細(xì)胞，置于37 ℃ 、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時(shí)即可用于轉(zhuǎn)染。

3 方法

3.1 實(shí)驗(yàn)分組和相關(guān)序列信息 本實(shí)驗(yàn)設(shè)立小鼠lncRNA-H19野生型和突變型(H19-Mut)，其中各型又分為5組：空白組(blank組，為單純的293T細(xì)胞)、miR-199a-5p模擬物組(miR-199a-5p組)、miR-199a-5p模擬物陰性對(duì)照(negative control, NC)組、miR-199a-5p抑制劑組(miR-199a-5p inhibitor組)和miR-199a-5p抑制劑陰性對(duì)照組(NC inhibitor組)。NC組采用通用的miRNA mimic N control #24，成熟miRNA名稱為cel-miR-67-3p，編號(hào)為MIMAT0000039。以上所涉及引物序列信息詳見表1。

表1 引物序列

F: forward; R: reverse.

3.2 小鼠lncRNA-H19表達(dá)載體及其突變載體構(gòu)建 分析lncRNA-H19基因序列，確定與miR-199a-5p潛在結(jié)合位點(diǎn)，H19擴(kuò)增引物序列由蘇州金唯智公司合成，PCR擴(kuò)增后進(jìn)行產(chǎn)物回收，再進(jìn)行載體雙酶切，XhoI酶切位點(diǎn)和NotI酶切位點(diǎn)見圖1和表1下劃線所示，擴(kuò)增片段為2 288 bp。將酶切回收的PCR產(chǎn)物與psiCHECK-2載體進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后質(zhì)粒提取并酶切鑒定陽性克隆，送陽性質(zhì)粒測(cè)序。H19突變采用overlap PCR法。測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)確認(rèn)H19以及H19-Mut已成功克隆至psiCHECK-2載體中。H19突變位點(diǎn)如圖2所示。

Figure 1.Vector structure map of psiCHECK.

圖1 psiCHECK-2載體結(jié)構(gòu)圖譜

Figure 2.Combination site of miR-199a-5p and lncRNA-H19, and mutation site of H19.

圖2 miR-199a-5p與lncRNA-H19結(jié)合位點(diǎn)及H19突變位點(diǎn)

3.3 陽離子脂質(zhì)體法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d，細(xì)胞按2×104cells/well接種于含10% FBS的DMEM 高糖培養(yǎng)基測(cè)定24孔板上。轉(zhuǎn)染當(dāng)天，細(xì)胞匯合度約為70%～80%，吸去舊的培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次，然后每孔加入300 μL OPTI-MEM培養(yǎng)基，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中；每個(gè)孔用OPTI-MEM培養(yǎng)基稀釋1 μL Lipofectamine 2000，終體積為50 μL，室溫下靜置5 min；每個(gè)孔加入20 μmol/L濃度的microRNA 1 μL或microRNA抑制劑和0.5 μg質(zhì)粒，再加入OPTI-MEM至總體積50 μL(最終孵育液中為50 nmol/L microRNA或100 nmol/L microRNA抑制劑)，室溫下靜置5 min；復(fù)合上述2個(gè)步驟中的稀釋液，室溫下靜置20 min；每孔加入100 μL轉(zhuǎn)染復(fù)合液，晃動(dòng)24孔板稍加混勻；在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育5 h，用新鮮的完全培養(yǎng)基(含F(xiàn)BS)替換含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基。

3.4 螢光素酶活性檢測(cè) 用Promega的雙螢光素酶基因報(bào)告分析系統(tǒng)進(jìn)行樣品螢光素酶活性檢測(cè)。 轉(zhuǎn)染48 h后，吸去舊的培養(yǎng)基，用PBS清洗2次，每孔細(xì)胞加入100 μL的PLB 緩沖液，室溫輕微振搖15 min，收集細(xì)胞裂解液。將20 μL細(xì)胞裂解液加入發(fā)光板后，用GloMax生物發(fā)光檢測(cè)儀讀取背景值2 s，每樣品加入100 μL LAR II工作液，快速混勻，讀值2 s。讀值完畢后，每樣品再加入100 μL Stop & Glo?Reagent，快速混勻后，放入發(fā)光檢測(cè)儀中，讀值2 s。記錄結(jié)果和保存數(shù)據(jù)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，報(bào)告基因分析中多組之間的差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni法，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 psiCHECK-2-H19雙螢光素酶報(bào)告基因載體的酶切鑒定和測(cè)序

psiCHECK-2-H19野生型和psiCHECK-2-H19 突變型酶切鑒定及測(cè)序結(jié)果均顯示，目的基因H19和其突變型均已成功轉(zhuǎn)入psiCHECK-2 載體中(圖3)。酶切結(jié)果分析可見H19(2 288 bp)在相應(yīng)的位置切出一條目的條帶(圖3紅色箭頭所指為目的片段)，psiCHECK-2-H19雙螢光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建成功。

Figure 3.Endonuclease digestion and sequence analysis of the constructed recombinant plasmid.

圖3 重組質(zhì)粒酶切鑒定和測(cè)序

2 Promega 雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示，miR-199a-5p模擬物與小鼠H19野生型和突變型報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞后，H19野生型miR-199a-5p模擬物組的雙螢光素酶活性相對(duì)值與空白組和NC組相比明顯降低，下調(diào)約49%(P<0.01)，而H19野生型miR-199a-5p抑制劑組雙螢光素酶活性相對(duì)值與H19野生型miR-199a-5p模擬物組相比明顯增加，上調(diào)48%(P<0.01)。miR-199a-5p模擬物、miR-199a-5p抑制劑、miR-199a-5p模擬物陰性對(duì)照和miR-199a-5p 抑制劑陰性對(duì)照對(duì)H19突變型螢光素酶活性無明顯影響，見圖4。

討 論

lncRNA 作為一類新型的非編碼RNA分子，在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中均發(fā)揮重要作用[5-7]，并且參與了細(xì)胞凋亡、增殖、分化等多種生物學(xué)過程[8]。lncRNA 已被證實(shí)與多種疾病的病理生理進(jìn)程密切相關(guān)。miRNA是一類對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控的分子，它能夠阻遏靶標(biāo)基因的翻譯，也可以導(dǎo)致mRNA降解，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的表達(dá)[9]?，F(xiàn)已證實(shí) lncRNA與miRNA存在緊密聯(lián)系，它可作為miRNA的前體，經(jīng)過序列剪切產(chǎn)生 miRNA[10]。由lncRNA單一鏈加工形成的miRNA可分布于多種不同的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)并執(zhí)行相應(yīng)的生物學(xué)功能。不僅如此，lncRNA還能夠與具有相同miRNA應(yīng)答元件的miRNA相結(jié)合，通過內(nèi)源性競爭抑制效應(yīng)調(diào)節(jié)相應(yīng)miRNA的表達(dá)水平，從而影響相關(guān)靶基因的表達(dá)[11]。

Figure 4.The results of Promega dual-luciferase reporter gene assay. Mean±SD.n=3.**P<0.05vsblank.

圖4 Promega 雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果

lncRNA-H19是最先被報(bào)道的lncRNA之一，也是最早發(fā)現(xiàn)的印記基因之一，進(jìn)化上高度保守，胚胎發(fā)育期呈高表達(dá)，出生后在大多數(shù)組織中表達(dá)下調(diào)[12]，在調(diào)控細(xì)胞生長、凋亡、擴(kuò)增及分化中具有重要作用，它能夠促進(jìn)細(xì)胞生長和對(duì)抗凋亡[13-14]，而miR-199a-5p則被證實(shí)能夠抑制細(xì)胞生存和產(chǎn)生促凋亡效應(yīng)[15]，小鼠的基因組在DNA和轉(zhuǎn)錄水平上與人類高度相似，目前小鼠模型已經(jīng)用于研究多種人類疾病，其在功能基因組學(xué)和臨床前藥物研發(fā)等領(lǐng)域是一個(gè)十分重要的模型系統(tǒng)。本研究首先采用生物信息學(xué)網(wǎng)站RegRNA 2.0數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)獲得小鼠lncRNA-H19和miR-199a-5p的可能結(jié)合位點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建含有小鼠H19野生型和突變型質(zhì)粒的雙螢光素酶報(bào)告載體，經(jīng)雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)分析H19與miR-199a-5p之間的靶向作用關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)，miR-199a-5p轉(zhuǎn)染組含H19野生型報(bào)告基因的螢光素酶活性顯著降低，miR-199a-5p 抑制劑組H19 野生型報(bào)告基因的螢光素酶活性則較miR-199a-5p組明顯增加，而miR-199a-5p模擬物、miR-199a-5p抑制劑以及陰性對(duì)照對(duì)H19突變型的表達(dá)均無明顯影響。以上結(jié)果說明了lncRNA-H19與miR-199a-5p存在靶向結(jié)合作用，其在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)miR-199a-5p 有直接的抑制作用。而lncRNA-H19對(duì)miR-199a-5p的這種抑制作用對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為方面的具體影響如何將有待于我們?cè)诮窈蟮难芯恐凶鲞M(jìn)一步的深入探索。

[1] Hou J, Zhou C, Long H, et al. Long noncoding RNAs: novel molecules in cardiovascular biology, disease and regeneration [J]. Exp Mol Pathol, 2016, 100(3):493-501.

[2] Eguchi T, Kuboki T. Cellular reprogramming using defined factors and microRNAs [J]. Stem Cells Int, 2016, 2016:7530942.

[3] Liu L, Yang J, Zhu X, et al. Long noncoding RNA H19 competitively binds miR-17-5p to regulate YES1 expression in thyroid cancer [J]. FEBS J, 2016, 283(12):2326-2339.

[4] Su Z, Zhi X, Zhang Q, et al. LncRNA H19 functions as a competing endogenous RNA to regulate AQP3 expression by sponging miR-874 in the intestinal barrier [J]. FEBS Lett, 2016, 590(9):1354-1364.

[5] 覃偉峰， 仉紅剛. lncRNA在心血管疾病中作用的研究進(jìn)展 [J].中國病理生理雜志，2016，32(8)：1471-1477.

[6] Schmitz SU, Grote P, Herrmann BG. Mechanisms of long noncoding RNA function in development and disease [J]. Cell Mol Life Sci, 2016, 73(13):2491-2509.

[7] Boon RA, Jaé N, Holdt L, et al. Long noncoding RNAs: from clinical genetics to therapeutic targets? [J]. J Am Coll Cardiol, 2016, 67(10):1214-1226.

[8] Piccoli MT, Gupta SK, Thum T. Noncoding RNAs as regulators of cardiomyocyte proliferation and death [J]. J Mol Cell Cardiol, 2015, 89(Pt A):59-67.

[9] Brümmer A, Hausser J. MicroRNA binding sites in the coding region of mRNAs: extending the repertoire of post-transcriptional gene regulation [J]. Bioessays, 2014, 36(6):617-626.

[10]Zhuang M, Gao W, Xu J, et al. The long non-coding RNA H19-derived miR-675 modulates human gastric can-cer cell proliferation by targeting tumor suppressor RUNX1 [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2014, 448(3):315-322.

[11]Ergun S, Oztuzcu S. Oncocers: ceRNA-mediated cross-talk by sponging miRNAs in oncogenic pathways [J]. Tumour Biol, 2015, 36(5):3129-3136.

[12]Ratajczak MZ. Igf2-H19, an imprinted tandem gene, is an important regulator of embryonic development, a guardian of proliferation of adult pluripotent stem cells, a regulator of longevity, and a ‘passkey’ to cancerogenesis[J]. Folia Histochem Cytobiol, 2012, 50(2):171-179.

[13]Kawahara M, Wu Q, Kono T. Involvement of insulin-like growth factor 2 in angiogenic factor transcription in bi-maternal mouse conceptuses [J]. J Reprod Dev, 2010, 56(1):79-85.

[14]He P, Zhang Z, Huang G, et al. miR-141 modulates osteoblastic cell proliferation by regulating the target gene of lncRNA H19 and lncRNA H19-derived miR-675[J]. Am J Transl Res, 2016, 8(4):1780-1788.

[15]Song J, Gao L, Yang G, et al. MiR-199a regulates cell proliferation and survival by targeting FZD7 [J]. PLoS One, 2014, 9(10):e110074.

(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Identification of targeting relationship between mouse lncRNA-H19 and miR-199a-5p by dual-luciferase reporter assay

HOU Jing-ying1, ZHOU Chang-qing1, ZHENG Shao-xin2, GUO Tian-zhu1, LONG Hui-bao1, WU Quan-hua1, ZHONG Ting-ting1, WU Hao1, WANG Lei1, WANG Tong1

(1DepartmentofEmergency,2DepartmentofCardiology,SunYat-senMemorialHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China.E-mail:tongwang316@163.com)

AIM: To validate the association between long noncoding (lncRNA)-H19 and microRNA-199a-5p (miR-199a-5p) through the dual-luciferase reporter gene system by construction of a luciferase reporter vector containing the gene of lncRNA-H19. METHODS: The potential complementary binding sites of lncRNA-H19 and miR-199a-5p were predicted by RegRNA 2.0. The H19 gene or its mutant (Mut) fragment was cloned into luciferase reporter vector psiCHECK-2. Restriction enzyme analysis and sequence analysis were used to identify whether the recombinant plasmids of the H19 and H19-Mut were successfully constructed. miR-199a-5p mimics, miR-199a-5p inhibitor, miR-199a-5p mimics negative control or miR-199a-5p inhibitor negative control was co-transfected into the 293T cells with the luciferase reporters containing H19 or H19-Mut. Dual-luciferase reporter assay was performed to detect the luciferase activity in different groups in order to verify the relationship between lncRNA-H19 and miR-199a-5p.RESULTS: The results of double enzyme digestion and DNA sequencing showed that the sequence of luciferase reporter vector was correct. The results of dual-luciferase reporter assay indicated that the H19 reporter gene luciferase activity significantly decreased in miR-199a-5p mimics group by 49% (P<0.01), and the H19 reporter gene luciferase activity was obviously upregulated in miR-199a-5p inhibitor group compared with miR-199a-5p mimics group (P<0.01). However, miR-199a-5p mimics, miR-199a-5p inhibitor, miR-199a-5p mimics negative control and miR-199a-5p inhibitor negative control showed no effect at H19-Mut reporter gene.CONCLUSION: lncRNA-H19 binds to miR-199a-5p to exert an inhibitory effect at transcriptional level.

Long noncoding RNA-H19; MicroRNA-199a-5p; Dual-luciferase reporter gene

1000- 4718(2016)12- 2256- 05

2016- 08- 23

2016- 10- 27

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81270213； No. 81070125； No. 81670306)；廣東省科技計(jì)劃(No. 2010B031600032； No. 2014A020211002)；高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)中山大學(xué)青年教師重點(diǎn)培育項(xiàng)目(No.13ykzd16)；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金資助項(xiàng)目(No. A2016264)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.12.022

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