裴仁治， 吳靜怡， 張丕勝， 劉旭輝， 杜小紅， 陳 冬， 沙科婭， 李雙月， 曹俊杰， 陳列光， 莊賢栩， 葉佩佩， 范 崢， 林 麗， 唐善浩， 張碧波， 史曉薇

(寧波大學醫(yī)學院附屬鄞州人民醫(yī)院血液科，浙江 寧波 315000)

急性早幼粒細胞患者治療前后循環(huán)內皮細胞的變化及其影響因素的分析*

裴仁治， 吳靜怡△， 張丕勝， 劉旭輝， 杜小紅， 陳 冬， 沙科婭， 李雙月， 曹俊杰， 陳列光， 莊賢栩， 葉佩佩， 范 崢， 林 麗， 唐善浩， 張碧波， 史曉薇

(寧波大學醫(yī)學院附屬鄞州人民醫(yī)院血液科，浙江 寧波 315000)

目的： 探討急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)患者治療前后循環(huán)內皮細胞(circulating endothelial cells，CECs)數量、表面抗原及生物學特性的變化，并分析其與臨床指標的關系。方法:免疫磁珠結合三色流式細胞儀分選計數APL患者初診及治療后CECs的數量；免疫熒光染色檢測APL患者初診及治療后CECs表面CD146、CD31、CD144、VEGFR-2、CD45及CD133的表達水平。體外培養(yǎng)CECs進行血管生成實驗及細胞集落形成率的測定。結果:APL患者 CECs在外周血白細胞>10×109/L及CD34陽性患者中數量明顯增多(P<0．05)，高危、低危及中危3組患者的CECs數量也呈現明顯的差異(P<0．05)。32例APL患者誘導化療后均獲得完全緩解，治療后CECs數量及其表面CD133表達水平均明顯下降(P<0．05)。同時治療后APL患者CECs體外形成血管數目及細胞的集落形成率均明顯減少(P<0．05)。APL患者CECs數量治療后/治療前的比值與As2O3治療1周后的尿砷濃度呈現明顯負相關性(P<0．05)。結論:精確計數并深入了解CECs生物學特性可能有助于評價APL的預后及設計治療策略。

急性早幼粒細胞白血??； 循環(huán)內皮細胞； 尿砷濃度

近年來多項研究顯示腫瘤循環(huán)內皮細胞(circulating endothelial cells，CECs)數量明顯增多，在腫瘤侵襲中發(fā)揮重要作用[1]。而血液惡性腫瘤中這種聯系則更為緊密[2]。國外學者在急性髓系白血病和慢性髓系白血病患者中均觀察到CECs數量增多且與疾病進展及預后相關的現象[3-4]。維甲酸及As2O3治療白血病的機制也包括對血管生成的抑制[5-6]，本研究旨在分離并精確計數急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)患者的CECs，對比治療前后CECs數量、表面抗原及生物學特性的變化，分析其與臨床指標的關系，探究CECs在腫瘤侵襲發(fā)展中的作用。

材 料 和 方 法

1 病例選擇

收集2012年7月～2015年12月來我院初診的APL患者32例， 男性18 例， 女性14例， 年齡 16～62歲，診斷及分期標準均符合張之南等主編的《血液病診斷及療效標準》。所有患者根據臨床特征及骨髓形態(tài)學特點高度提示APL時，立即予維甲酸25 mg/d(分3次口服)，As2O3注射液10 mg/d (購自哈爾濱伊達藥業(yè)責任有限公司)靜脈滴注治療，直至骨髓完全緩解(bone complete remission，BCR)。治療中若白細胞(WBC)≥10×109/L，加用高三尖杉酯堿1～4 mg/d，WBC降至10×109/L以下停藥。患者BCR后序貫實施化療、維甲酸和As2O3交替治療。以上研究方案獲得我院倫理委員會批準，受試者在受試前知情同意并簽署知情同意書。

2 試劑和儀器

人淋巴細胞分離液(Ficoll)購自中國醫(yī)學科學院生物工程醫(yī)學研究所；添加各種生長因子和胎牛血清的內皮細胞完全培養(yǎng)基(EGMTM-2MV SingleQuotsTM)和胰蛋白酶為Becton Dickinson產品； VEGFR-2鼠抗人單抗購自R&D；CD31鼠抗人單抗購自上海長島公司；羊抗鼠FITC標記的 II 抗購自Sigma；PE標記的CD144鼠抗人單抗購自Beckman Coulter；FITC標記的CD133、FITC標記的CD45和PE標記的CD146鼠抗人單抗均購自BD；CD146磁珠溶液購自Miltenyi Biotec。FACSCantoTMII型流式細胞儀購自BD。

3 實驗方法

3.1 外周血中分離并計數CECs 初治患者于無菌操作下取靜脈血(EDTA抗凝)5 mL，稀釋后加入紅細胞裂解液靜置10 min，洗滌后與Fc受體阻斷劑置于4 ℃上30 min，與CD146磁珠溶液室溫孵育25 min后上柱分選，富集的細胞洗滌后調整體積至300 μL，均分成2管，即樣品管(T2)和空白對照管(T1)，T1和T2管中均加入FIFC標記的CD45單克隆抗體20 μL，T2管中加入PE標記的CD146單克隆抗體20 μL，T1管中加入20 μL同型對照，調整溶液體積至200 μL。4 ℃保存至上機檢測。流式細胞術檢測CD146+、CD45-、PI+的有核細胞。具體方法詳見文獻[7]。

3.2 細胞表面抗原的免疫熒光檢測 將分選的細胞制成細胞滴片，用4%的多聚甲醛室溫下固定30 min，用小牛血清封閉30 min，加工作濃度的 I 抗及FITC標記的 II 抗，嚴格按照說明步驟進行，結果在熒光顯微鏡下觀察，計數200個細胞。

3.3 體外血管生成實驗 用完全培養(yǎng)重懸液分選得到的細胞，接種到2%明膠包被的25 mL塑料培養(yǎng)瓶中進行體外培養(yǎng)。應用纖維蛋白凝膠體外血管生成試劑盒行體外血管生成實驗。96孔培養(yǎng)板每孔依次加入30 μL 人纖維蛋白原與20 μL凝血酶，晃均，37 ℃ 30 min成凝膠；加入5×106/L細胞懸液培養(yǎng)過夜；去除培養(yǎng)液，依次加入30 μL人纖維蛋白原與20 μL凝血酶，晃均，加100 μL培養(yǎng)液，24 h。顯微鏡下觀察管腔形成情況，隨機選取3個視野(×200)計血管數目，重復計數3次。

3.4 細胞集落形成率測定 取接近融合細胞，洗滌消化后制成細胞懸液，按2×104/L的密度接種到6孔板中培養(yǎng)，當培養(yǎng)板中出現克隆時，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，洗滌后加4%甲醛5 mL固定細胞15 min，加適量姬姆薩液染色30 min，計數孔中集落數，以含50個以上細胞團為1個集落。每次培養(yǎng)6個孔，取平均值。

3.5 尿砷測定 于治療前、治療后1周及2周分別留取患者晨尿50 mL，將尿液樣品與2 mol/L NaOH等體積比混合，于100 ℃恒溫消化3 h，采用氫化物發(fā)生-冷井捕集-原子吸收光譜法檢測各時點尿砷的含量。

4 統計學處理

采用SPSS 17.0統計軟件進行分析，計量數據以均數±標準差(mean±SD)表示， 兩組均數間的比較采用Mann-WhitneyU檢驗，對CECs數量治療后/治療前比值與臨床治療指標間的相關性采用Pearson相關分析，以P<0．05為差異有統計學意義。

結 果

1 APL患者臨床特征及其與CECs數量的關系

32例APL患者具體臨床資料詳見表1，其中4例患者CD34免疫分型呈陽性，其CECs數量與CD34陰性患者相比明顯增多(P<0．05)，外周血白細胞 >10×109/L患者的CECs數量明顯多于白細胞 ≤10×109/L的患者(P<0．05)。高危、低危及中危3組患者的CECs數量呈現明顯的差異(P<0．05)。

APL患者CECs的數量與患者初診時的年齡、性別、體力狀況評分、血小板計數、是否合并DIC、PML/RARa基因亞型等臨床指標無明顯相關性。

2 APL患者治療前后CECs數量及表面抗原的變化

APL患者初診時CECs中位數為38 (0～152)/mL，治療后為11 (0～49)/mL，兩者相比差異有統計學顯著性(P<0．05)。

APL患者CECs均高表達CD31、CD144、VEGFR-2和CD146，基本不表達白細胞共同抗原CD45，鑒定為血管內皮細胞。而CD133是內皮祖細胞的標志物[4]。32例APL患者誘導化療后均獲完全緩解，CD133的陽性率較初診時明顯下降(P<0．05)。而CD31、CD144、VEGFR-2和CD146的表達在治療前后并無明顯變化，見表2。

3 APL患者治療前后CECs體外血管形成及集落生成數的比較

APL患者(n=10)初診時CECs在纖維蛋白凝膠上形成的管腔結構數目(3個隨機視野管腔數之和)為19.0±1.8，而治療后(8.6±3.2)則明顯減少(P<0.05)，且形成的管腔相對欠圓潤(圖1)。初診時CECs集落生成率為(4.44±1.82)/108MNCs，與治療后[(0.89±1.17)/108MNCs]相比差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

4 APL患者CECs數量治療后/治療前的比值與臨床治療指標的相關性

32例APL患者誘導化療獲CR時間平均為(30.0±5.6) d，高三尖杉酯堿平均用量(13.80±4.54) mg，維甲酸平均用量(873.80±129.03) mg，

表1 APL患者CECs數量與臨床特征的關系

Table 1.CECs quantity and clinicopathologic features of the 32 APL patients (Mean±SD)

VariableCases(%)CECs(/mL)PvalueTotal3244.72±41.45Gender Male19(59.4)42.52±45.12>0.05 Female13(40.6)47.53±37.46Age(year) <5020(62.5)45.10±45.40>0.05 ≥5012(37.5)43.67±36.31ECOG 0～221(65.6)48.38±46.74>0.05 3～411(34.4)37.27±30.18WBC(×109/L) ≤1027(84.4)33.48±31.59<0.01 >105(15.6) 101.80±40.96Platelet(×109/L) ≤4026(81.3)50.73±43.29>0.05 >406(18.7)17.83±17.68WithDIC No15(46.9)36.87±35.69>0.05 Yes17(53.1)51.41±46.15PML/RARa S14(42.8)32.50±29.22>0.05 L18(56.2)54.00±47.80Riskfactor Low12(37.5)28.75±31.07<0.05 Medium15(46.9)37.27±32.57 High5(15.6)101.80±40.96WithCD34positive No28(87.5)38.67±37.30<0.05 Yes4(12.5)85.75±52.81

As2O3平均用量(236.3±25.6) mg，而APL患者CECs數量治療后/治療前的比值與達CR時間、高三尖杉酯堿、維甲酸及As2O3用量均無相關性。APL患者CECs數量治療后/治療前的比值與初診時及As2O3治療2周后的尿砷濃度無相關性，但與As2O3治療1周后的尿砷濃度呈現明顯負相關性(P<0.05)，見圖3。

表2 APL患者治療前后CECs表面標記的變化

*P<0．05vsbefore treatment.

Figure 1.The angiogenesis of CECs from APL patients before (A) and after (B) treatmentinvitro(×200).

圖1 APL患者治療前與治療后CECs體外血管生成的比較

Figure 2.The colony-forming rates of CECs from APL patients before and after treatment. Mean±SD.n=10.*P<0．05vsbefore treatment.

圖2 APL患者治療前與治療后CECs集落形成率的比較

Figure 3.Correlation between the ratio of CECs counts from APL patients after therapy to that before therapy and arsenic concentration in urine on day 7 during As2O3treatment.

圖3 APL患者CECs數量治療后/治療前的比值與As2O3治療1周后的尿砷濃度的相關性分析

討 論

為解決CECs數量極少難以計數的困難，將免疫磁珠富集細胞后鏡下計數過程轉接給流式細胞儀，不僅可以精確計數內皮細胞，還能有效避免紅細胞碎片、血小板及白細胞的污染。實驗中分離的細胞呈現鋪路石樣的典型血管內皮細胞形態(tài)，同時高表達CECs的表面抗原CD31、CD144和VEGFR-2[8]。

實驗中APL患者初診時CECs數量在高白細胞及CD34陽性患者中明顯增多，在危險度分組中有差異。而臨床上高白細胞及CD34+的患者早期死亡率高，治療反應差[9]，說明血管生成與疾病預后密切相關。而腫瘤患者CECs數量是反映腫瘤惡性程度的重要指標[10]。APL患者完全緩解后CECs數量明顯減少，提示CECs數量與腫瘤負荷密切相關。與國外學者在實體腫瘤中觀察到的現象一致[11]。

同時APL患者CECs的生物學特性在治療后也發(fā)生變化，CD133的陽性率明顯下降，在體外形成血管的能力下降。集落形成實驗的結果也驗證了這一點，治療后APL患者CECs的集落形成也減少，提示治療后CECs更多的表現出成熟內皮細胞的特征。

國內學者報道維甲酸及As2O3對血管生成有抑制作用，但實驗中并未發(fā)現CECs數量下降與維甲酸、As2O3用量的相關性，可能與治療過程中影響因素較多及藥物體內代謝的復雜性有關。多項藥代動力學研究表明[12-13]，As2O3在體內代謝的個體差異極大，用藥1周后患者的尿砷濃度趨于穩(wěn)定，實驗中發(fā)現此時的尿砷濃度越高，CECs數量下降越明顯，說明尿砷濃度的監(jiān)測能為個體化精準用藥提供幫助。

綜上所述，精確計數CECs在白血病臨床診療中能發(fā)揮判斷治療反應及評價預后的重要作用，并有助于白血病治療機制及個體化精準治療方案的探索。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Alteration of circulating endothelial cells from acute promyelocytic leukemia patients before and after treatment and its influential factors

PEI Ren-zhi, WU Jing-yi, ZHANG Pi-sheng, LIU Xu-hui, DU Xiao-hong, CHEN Dong, SHA Ke-ya, LI Shuang-yue, CAO Jun-jie, CHEN Lie-guang, ZHUANG Xian-xu, YE Pei-pei, FAN Zheng, LIN Li, TANG Shan-hao, ZHANG Bi-bo, SHI Xiao-wei

(DepartmentofHematology,YinzhouPeople’sHospitalAffiliatedtoMedicalSchoolofNingboUniversity,Ningbo315000,China.E-mail:smiles100@126.com)

AIM: To determine the biological feature of circulating endothelial cells (CECs) in acute promyelocytic leukemia (APL) patients before and after treatment, and to analyze the relationship between CECs and the clinical characteristics. METHODS: The CECs were sorted from peripheral blood by magnetic-activated cell sorting and then counted by 3-color flow cytometry. The cells were identified by immunofluorescence staining for the expression of CD146, CD31, CD144, VEGFR-2, CD45 and CD133. The CECs were culturedinvitro, and the tube formation and colony-forming rate were determined.RESULTS: Increased quantity of CECs was observed in CD34 positive group and group with WBC>10×109/L (P<0.05). The quantity of CECs had a significant difference among low risk, medium risk and high risk groups (P<0.05). The positive rate of CD133 and quantity of CECs significantly reduced in 32 APL patients when they gain complete remission after treatment (P<0.05). The amount of tube formation and colony-forming rate were significantly reduced after treatment (P<0.05). The ratio of CECs quantity from APL patients after treatment to that before treatment had a negative correlation with arsenic concentration in urine on day 7 during As2O3treatment (P<0．05). CONCLUSION: Accurately counting CECs may be helpful for evaluating prognosis and designing treatment strategy.

Acute promyelocytic leukemia; Circulating endothelial cells; Arsenic concentration in urine

1000- 4718(2016)12- 2282- 05

2016- 06- 20

2016- 10- 19

浙江省自然科學基金資助項目(No. LQ12H08001)；浙江省衛(wèi)生廳一般研究項目資助(No. 201235256)；寧波市自然科學基金資助項目(No. 2012A610236)；寧波市醫(yī)學科技計劃資助項目(No. 2011B23)

R730.23； R733.71

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.12.027

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