舒朝輝， 曾振華， 黃秋菊， 李忠洪， 劉培慶， 陳少銳， 蘭 天， 臧林泉， 周四桂△

(1廣東藥科大學(xué)臨床藥學(xué)系，廣東 廣州 510006； 2中山大學(xué)藥學(xué)院藥理與毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006)

短鏈?；o酶A脫氫酶在心臟成纖維細(xì)胞膠原表達(dá)和細(xì)胞增殖中的作用*

舒朝輝1， 曾振華1， 黃秋菊1， 李忠洪1， 劉培慶2， 陳少銳2， 蘭 天1， 臧林泉1， 周四桂1△

(1廣東藥科大學(xué)臨床藥學(xué)系，廣東 廣州 510006；2中山大學(xué)藥學(xué)院藥理與毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006)

目的： 研究短鏈酰基輔酶A脫氫酶(short-chain acyl-CoA dehydrogenase，SCAD)在心臟成纖維細(xì)胞膠原表達(dá)和細(xì)胞增殖中的作用，探討其與心肌纖維化之間的關(guān)系。方法:以血管緊張素II(angiotensin II，Ang II)刺激心臟成纖維細(xì)胞建立膠原表達(dá)和細(xì)胞增殖模型，并采用SCAD的最優(yōu)干擾序列siRNA-1186進(jìn)行干擾，檢測(cè)SCAD的mRNA、蛋白表達(dá)、酶活性、脂肪酸β氧化速率、ATP以及游離脂肪酸含量的變化；觀察其對(duì)心臟成纖維細(xì)胞膠原表達(dá)和細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果:與對(duì)照組相比，在Ang II誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞增殖和膠原表達(dá)模型中，SCAD的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)。與陰性對(duì)照序列組相比，siRNA-1186干擾后心臟成纖維細(xì)胞的SCAD表達(dá)和酶活性明顯下降，心臟成纖維細(xì)胞脂肪酸β氧化速率以及ATP生成明顯降低，并且游離脂肪酸含量明顯增多。同時(shí)，心臟成纖維細(xì)胞出現(xiàn)明顯增殖，I、III型膠原的表達(dá)明顯增加。結(jié)論:SCAD表達(dá)失調(diào)可能導(dǎo)致了心臟成纖維細(xì)胞異常增殖、膠原分泌紊亂，上調(diào) SCAD可能成為干預(yù)心肌纖維化的重要環(huán)節(jié)之一。

短鏈?；o酶A脫氫酶； 心臟成纖維細(xì)胞； 心肌纖維化； 能量代謝； 膠原

心臟主要由心肌細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成，而間質(zhì)細(xì)胞中心臟成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts)占到了40%～60%[1-2]，心臟成纖維細(xì)胞不僅對(duì)心肌細(xì)胞有結(jié)構(gòu)上的支持和保護(hù)作用，還具有自分泌和旁分泌功能，而且會(huì)影響心肌的結(jié)構(gòu)和生理功能。目前認(rèn)為，心肌肥厚是增加高血壓致殘率和致死率的一個(gè)重要獨(dú)立危險(xiǎn)因素，并且心臟成纖維細(xì)胞的增殖是導(dǎo)致心肌肥厚重要的病理生理基礎(chǔ)[3]。在肥厚后期，心臟成纖維細(xì)胞增殖以及膠原分泌紊亂，進(jìn)一步發(fā)展為心肌纖維化，最終導(dǎo)致心力衰竭。然而，誘發(fā)心臟成纖維細(xì)胞增殖和膠原表達(dá)紊亂的相關(guān)因素以及線粒體在心臟成纖維細(xì)胞增殖和膠原表達(dá)中的機(jī)制尚未完全闡明。

心肌是耗能最多的組織之一。哺乳動(dòng)物胚胎期心臟主要以葡萄糖和乳酸作為能源，出生后則為以脂肪酸氧化為主；但在病理性心肌肥厚時(shí)脂肪酸氧化降低，糖酵解增加，心肌能量代謝發(fā)生“胚胎型轉(zhuǎn)換”[4]。短鏈?；o酶A脫氫酶(short-chain acyl-CoA dehydrogenase，SCAD)是?；o酶A脫氫酶家族中的一員，特異性地分解短鏈?；o酶A底物，是脂肪酸 β 氧化的第一個(gè)限速步驟，是脂肪酸氧化的關(guān)鍵酶[5]。我們采用定量蛋白質(zhì)組學(xué) DIGE技術(shù)比較16周齡自發(fā)性高血壓大鼠和血壓正常大鼠的心肌蛋白質(zhì)組，首次發(fā)現(xiàn)SCAD 在自發(fā)性高血壓大鼠肥厚心肌中的表達(dá)明顯降低[6]。而在后續(xù)的研究中也發(fā)現(xiàn)，SCAD對(duì)病理性心肌肥厚和心肌細(xì)胞凋亡具有負(fù)性調(diào)控作用[7-9]。心肌纖維化是病理性心肌肥厚由代償向失代償轉(zhuǎn)化的重要病理過程，是引發(fā)心力衰竭的核心環(huán)節(jié)[10]。然而，SCAD在心肌纖維化中的作用尚不清楚。

本研究在細(xì)胞水平模擬心肌纖維化，以血管緊張素II(angiotensin II,AngⅡ)建立心臟成纖維細(xì)胞增殖和膠原表達(dá)模型，觀察SCAD在心臟成纖維細(xì)胞增殖和膠原表達(dá)中的作用，從心臟能量代謝方面探討心肌纖維化的發(fā)病機(jī)制，以期為心肌纖維化尋找新的分子標(biāo)志物，并為心肌纖維化治療尋找新的藥物作用靶點(diǎn)。

材 料 和 方 法

1 材料

RT-PCR 測(cè)定試劑盒、TRIzol和 SYBR Green購(gòu)于 TaKaRa； II型膠原酶購(gòu)于Gibco；BCA 蛋白定量試劑盒和 Western blot發(fā)光液購(gòu)于 Thermo；亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)線粒體提取試劑盒以及臺(tái)盼藍(lán)購(gòu)于博士德生物；脂肪酸β氧化速率比色法檢測(cè)試劑盒和細(xì)胞 SCAD 活性比色法定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海杰美基因；血管緊張素II和單克隆鼠抗 α-tubulin購(gòu)于Sigma；單克隆兔抗 SCAD 購(gòu)于 Abcam；I、III型膠原抗體購(gòu)于Proteintech；羥脯氨酸和游離脂肪酸測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所; CCK-8試劑盒購(gòu)于Dojindo；ATP檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 SD大鼠原代心臟成纖維細(xì)胞培養(yǎng) 采用本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表的方法分離及培養(yǎng)成年大鼠心臟成纖維細(xì)胞[9]，取200～250 g雄性大鼠，頸椎脫臼法處死，在無菌條件下取出心臟，采用膠原酶-胰酶-膠原酶循環(huán)消化法，得到單細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞后差速貼壁1 h去除心肌細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。按照上述分離制備的心臟成纖維細(xì)胞，經(jīng)vimentin抗體的免疫細(xì)胞化學(xué)染色，純度可達(dá)98%以上。2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 細(xì)胞以每孔5×103個(gè)接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，給予不同濃度Ang II(0.1、1、10、100、1 000 nmol/L)刺激細(xì)胞24 h或者濃度100 nmol/L的Ang II 作用細(xì)胞不同時(shí)間(6、12、24、36、48 h)，每孔加入10 μL CCK-8溶液，4 h后用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度(A)值。

2.3 臺(tái)盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞以每孔1×104個(gè)接種于12孔板，待細(xì)胞貼壁后，給予不同濃度Ang II(0.1、1、10、100、1 000 nmol/L)刺激細(xì)胞24 h或者濃度100 nmol/L的Ang II 作用細(xì)胞不同時(shí)間(6、12、24、36、48 h)，制備單細(xì)胞懸液，用濃度為0.1%的臺(tái)盼藍(lán)染色，3 min內(nèi)，用計(jì)數(shù)板分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞。鏡下觀察，死細(xì)胞被染成藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染。

2.4 Real-time PCR檢測(cè) mRNA 的表達(dá) 按照TRIzol說明書步驟提取細(xì)胞總 RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA樣品的260和280 nm波長(zhǎng)下的A值，檢測(cè)純度并計(jì)算出 RNA的濃度。參照RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。按照SYBR Green說明書反應(yīng)體系加入熒光染料、引物和RT 產(chǎn)物后在Bio-Rad CFX96 PCR儀中進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 10 s； 95 ℃ 5 s， 60 ℃ 30 s，循環(huán)40次。引物由上海生工合成，具體引物序列見表1。

表 1 Real-time PCR實(shí)驗(yàn)的引物序列

2.5 Western blot法檢測(cè)蛋白的表達(dá) 提取各組心臟成纖維細(xì)胞總蛋白， BCA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞蛋白含量后調(diào)整上樣量，分裝、變性，配置10% SDS分離膠和5% 濃縮膠進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Bio-Rad)，室溫封閉1 h 后加入I抗(SCAD，1∶1 000；Collagen I, 1∶1 000; Collagen III, 1∶1 000; α-tubulin，1∶10 000)，過夜。漂洗后加II抗，室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光試劑增強(qiáng)反應(yīng)， X線壓片曝光、顯影、定影，結(jié)果采用ImageJ 圖像分析系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行分析。

2.6 SCAD 酶活性的檢測(cè) 按照實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞，收集細(xì)胞后置于冰上裂解 30 min，取上清液用BCA蛋白定量試劑盒定量蛋白。酶活性檢測(cè)是基于 2,6-二氯靛酚鈉(2,6-dichlorophenol indophenol，DCPIP)作為人工電子受體，替代黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD)，在 SCAD 的作用下，由短鏈?；o酶 A 提供的電子， 經(jīng)過硫酸甲酯吩嗪(phenazine methosulphate，PMS)的傳遞，被還原為無色產(chǎn)物，通過分光光度儀的峰值變化(600 nm 波長(zhǎng))來定量分析 SCAD 的活性。嚴(yán)格按照說明書采用酶標(biāo)儀法進(jìn)行檢測(cè)。

2.7 siRNA干擾 siRNA干擾序列購(gòu)于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。采用本實(shí)驗(yàn)室篩選出的最優(yōu)干擾序列siRNA-1186進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其正義鏈序列為5’-CCGCAUCACUGAGAUCAUTT-3’，反義鏈序列為5’-AUAGAUCUCAGUGAUGCGGTT-3’。轉(zhuǎn)染方法按照公司提供的轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。

2.8 膠原合成的檢測(cè) 通過測(cè)定細(xì)胞中羥脯氨酸的含量反映膠原合成情況。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照說明書采用酶標(biāo)儀法進(jìn)行檢測(cè)。羥脯氨酸含量(mg/L)=(測(cè)定A值-空白A值)/(標(biāo)準(zhǔn)A值-空白A值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

2.9 脂肪酸β氧化速率的檢測(cè) 使用差速離心法提取細(xì)胞中的線粒體，嚴(yán)格按照亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)線粒體提取試劑盒說明書操作。比色法測(cè)定脂肪酸β氧化速率是一種通過底物棕櫚酰肉堿的氧化產(chǎn)生電子，由鐵氰化物捕獲而還原，其還原速率的檢測(cè)用來評(píng)價(jià)脂肪酸β氧化的速率，具體操作嚴(yán)格按照脂肪酸β氧化速率比色法檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行。

2.10 游離脂肪酸含量的測(cè)定 游離脂肪酸能與銅離子結(jié)合形成脂肪酸銅鹽而溶于氯仿中，其含量與游離脂肪酸含量成正比，用銅試劑測(cè)定其中的銅離子含量，即可推算出游離脂肪酸的含量。我們采用游離脂肪酸測(cè)定試劑盒(比色法)檢測(cè)心臟成纖維細(xì)胞中游離脂肪酸的含量，操作方法嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

2.11 ATP含量的測(cè)定 ATP檢測(cè)試劑盒根據(jù)螢火蟲螢光素酶催化螢光素發(fā)光時(shí)需要ATP提供能量的原理而設(shè)計(jì)。當(dāng)螢火蟲螢光素酶和螢光素都過量時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度與ATP濃度在一定范圍內(nèi)成正比。操作方法嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，組間比較采用單因素方差分析，運(yùn)用Bonferronit檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Ang II對(duì)心臟成纖維細(xì)胞增殖的影響

CCK-8比色法檢測(cè)不同濃度Ang II (0.1、1、10、100、1 000 nmol/L)刺激心臟成纖維細(xì)胞 24 h后，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞增殖呈濃度依賴性，且Ang II濃度為100 nmol/L和1 000 nmol/L時(shí)，二者無顯著性差異; 用100 nmol/L Ang II 處理不同時(shí)間(0、6、12、24、36、48 h)后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖呈時(shí)間依賴性，且Ang II處理36 h和48 h時(shí)無顯著性差異 。此外，臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果表明，心臟成纖維細(xì)胞數(shù)量在100 nmol/L Ang II處理不同時(shí)間(0、6、12、24、36、48 h)后，基本呈現(xiàn)時(shí)間依賴性，且在36 h和48 h無顯著性差異； 在不同濃度Ang II (0.1、1、10、100、1 000 nmol/L)刺激下表現(xiàn)出濃度依賴性，且在100 nmol/L時(shí)有顯著性差異。因此，我們選擇濃度為100 nmol/L的Ang II作用36 h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的條件,見圖1。

2 Ang II對(duì)心臟成纖維細(xì)胞中SCAD的mRNA和蛋白表達(dá)的影響

Real-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著Ang II 處理時(shí)間和濃度的增加，心臟成纖維細(xì)胞內(nèi)SCAD的mRNA表達(dá)明顯下調(diào)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果與 real-time PCR結(jié)果呈現(xiàn)一致的趨勢(shì)，SCAD的蛋白表達(dá)均出現(xiàn)下調(diào)，以濃度100 nmol/L Ang II作用36 h和48 h時(shí)，SCAD的下調(diào)最為顯著(P<0.01)，見圖2。

Figure 1.The cell proliferation in Ang II-treated cardiac fibroblasts detected by CCK-8 assay (A, B) or cell counting after Trypan blue staining (C, D). A, C: the cardiac fibroblasts were treated with 100 nmol/L Ang II for various incubation time periods; B, D: the cardiac fibroblasts were treated with different concentrations of Ang II for 36 h. Con: control. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsCon.

圖1 各組心臟成纖維細(xì)胞的增殖情況

Figure 2. The expression of SCAD at mRNA (A, B) and protein (C, D) levels in Ang II-treated cardiac fibroblasts. A, C:the cardiac fibroblasts were treated with Ang II for different time periods; B, D: the cardiac fibroblasts were treated with different concentrations of Ang II for 36 h. Con: control. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsCon.

圖2 Ang II 刺激后心臟成纖維細(xì)胞SCAD mRNA和蛋白表達(dá)的變化

3 Ang II和siRNA-1186對(duì)心臟成纖維細(xì)胞SCAD表達(dá)、SCAD酶活性、脂肪酸β氧化速率、ATP及游離脂肪酸含量的影響

用siRNA-1186干擾序列轉(zhuǎn)染心臟成纖維細(xì)胞， 可見siRNA可以明顯減少心臟成纖維細(xì)胞中SCAD的mRNA和蛋白表達(dá)量，降低SCAD的酶活性。此外，心臟成纖維細(xì)胞對(duì)脂肪酸的氧化能力下降，表現(xiàn)在脂肪酸β氧化速率的下降以及ATP生成的減少。與陰性對(duì)照組相比，siRNA-1186組的脂肪酸β氧化速率顯著下降，ATP生成也明顯減少，且心臟成纖維細(xì)胞內(nèi)游離脂肪酸含量顯著增多，其程度與刺激因素Ang II作用于心臟成纖維細(xì)胞的結(jié)果一致，表明SCAD的表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致了心臟成纖維細(xì)胞脂肪酸 β 氧化能力下降,見圖3。

Figure 3. The expression and activity of SCAD, fatty acid beta-oxidation rate, ATP content and free fatty acid content in the cardiac fibroblasts treated with Ang II (100 nmol/L, 36 h) or siRNA-1186 (72 h). Con: control； NC: negative control. Mean±SD.n=3. *P<0.05,**P<0.01vsCon;#P<0.05,##P<0.01vsNC.

圖3 siRNA-1186和Ang II對(duì)心臟成纖維細(xì)胞SCAD mRNA和蛋白表達(dá)、SCAD酶活性、脂肪酸β氧化速率、ATP和游離脂肪酸含量的影響

4 Ang II和siRNA-1186對(duì)心臟成纖維細(xì)胞增殖的影響

由圖4可見，與陰性對(duì)照序列組相比，siRNA-1186干擾序列通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染敲低SCAD基因的表達(dá)后，CCK-8結(jié)果表明心臟成纖維細(xì)胞的增殖明顯增強(qiáng)，其程度與刺激因素Ang II誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖趨勢(shì)一致；此外，臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果也表明，siRNA-1186干擾序列通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染敲低SCAD基因的表達(dá)后，心臟成纖維細(xì)胞的數(shù)量出現(xiàn)顯著性增長(zhǎng)，與CCK-8結(jié)果一致。這表明SCAD表達(dá)量的降低可能是造成心臟成纖維細(xì)胞出現(xiàn)增殖的一個(gè)重要因素。

Figure 4.The cell proliferation was measured 72 h after transfection with siRNA-1186 or treated with Ang II for 36 h by CCK-8 assay(A) and Trypan blue staining (B). Con: control； NC: negative control. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsCon；##P<0.01vsNC.

圖4 siRNA-1186和Ang II對(duì)心臟成纖維細(xì)胞增殖的影響

5 Ang II和siRNA-1186對(duì)心臟成纖維細(xì)胞羥脯氨酸含量的影響

由圖5可見，用siRNA-1186干擾序列敲低SCAD的表達(dá)后，心臟成纖維細(xì)胞內(nèi)羥脯氨酸的含量顯著增加，與Ang II 誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞增殖導(dǎo)致的羥脯氨酸含量變化趨勢(shì)一致。這表明SCAD的下調(diào)可能導(dǎo)致了心臟成纖維細(xì)胞膠原合成能力的改變。

Figure 5. Collagen synthesis was determined by hydroxyproline assay in the cardiac fibroblasts treated with Ang II at 100 nmol/L for 36 h or transfected with siRNA-1186 for 72 h. Con：control; NC: negative control. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsCon;##P<0.01vsNC.

圖5 siRNA-1186和Ang II 對(duì)心臟成纖維細(xì)胞羥脯氨酸含量變化的影響

6 Ang II和siRNA-1186對(duì)心臟成纖維細(xì)胞I、III型膠原mRNA和蛋白表達(dá)的影響

siRNA-1186干擾序列敲低SCAD的表達(dá)后，心臟成纖維細(xì)胞 I、III型膠原的表達(dá)較陰性對(duì)照組顯著上升，與Ang II 刺激心臟成纖維細(xì)胞導(dǎo)致的I、 III

型膠原表達(dá)趨勢(shì)一致，且real-time PCR與Western blot實(shí)驗(yàn)的結(jié)果保持一致。這表明SCAD的下調(diào)可能導(dǎo)致了心臟成纖維細(xì)胞I、III型膠原的表達(dá)紊亂,見圖6。

討 論

心肌纖維化是由于心臟成纖維細(xì)胞過度增殖，導(dǎo)致膠原蛋白過量積聚，膠原成分發(fā)生改變或濃度增加所引起的病理過程。主要表現(xiàn)為各型膠原比例失衡，膠原蛋白含量增加及其結(jié)構(gòu)重排，進(jìn)而影響心臟功能，最終導(dǎo)致心力哀竭的發(fā)生。心肌纖維化是多種心臟疾病發(fā)展的共同結(jié)局，可導(dǎo)致心臟收縮功能障礙、心律失常及室顫的發(fā)生，最終演變成難以治療的充血性心力衰竭[11]。因此，防治心肌纖維化的研究具有重要臨床意義。

目前認(rèn)為，心臟能量代謝有望成為治療心力衰竭的靶點(diǎn)[12-13]，并且對(duì)心臟能量代謝的研究主要集中于心肌細(xì)胞。我們的前期研究首次發(fā)現(xiàn)，與能量代謝密切相關(guān)的SCAD參與調(diào)控病理性心肌肥厚與心肌細(xì)胞凋亡[7,14]。然而，心臟成纖維細(xì)胞也是心臟的重要組成部分，參與了心肌纖維化進(jìn)程。此外，心肌纖維化是心肌肥厚由代償向失代償轉(zhuǎn)化的重要病理過程，是引發(fā)心力衰竭的核心環(huán)節(jié)[15]。在心肌肥厚中心肌細(xì)胞能量代謝異常已有大量報(bào)道[16-18]，然而，心肌纖維化時(shí)心臟成纖維細(xì)胞的能量代謝是否發(fā)生變化鮮有報(bào)道。因此，從心肌能量代謝角度防治心肌纖維化，延緩心力衰竭進(jìn)程，可能是一條新思路。

Figure 6. The expression of collagen I and collagen III in the cardiac fibroblasts treated with Ang II (100 nmol/L, 36 h) or siRNA-1186 (72 h). A: the mRNA expression of collagen I and collagen III by real-time PCR; B: the representative images and quantitative analysis of Western blotting for determining the protein levels of collagen I and collagen III. Con: control; NC: negative control. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsCon;##P<0.01vsNC.

圖6 siRNA-1186和Ang II對(duì)心臟成纖維細(xì)胞I、III型膠原mRNA和蛋白表達(dá)的影響

線粒體的脂肪酸 β 氧化經(jīng)過脫氫、水化、再脫氫和硫解4個(gè)步驟產(chǎn)生能量。SCAD是?；o酶A脫氫酶家族成員之一，直接參與脂肪酸β氧化第一步的脫氫過程。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，SCAD負(fù)性調(diào)控病理性心肌肥厚和心肌細(xì)胞凋亡[8, 14]。由于心臟成纖維細(xì)胞的增殖和膠原代謝失衡是引發(fā)心肌纖維化的重要環(huán)節(jié)，而SCAD是否參與心肌纖維化過程尚未見報(bào)道。因此，我們進(jìn)一步探討了SCAD在心臟成纖維細(xì)胞增殖以及膠原表達(dá)中的作用。

在本研究中，我們采用Ang II誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞增殖模型，觀察不同濃度Ang II作用24 h或100 nmol/L Ang II作用不同時(shí)間對(duì)心臟成纖維細(xì)胞增殖的影響。CCK-8以及臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果提示，Ang II誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞增殖具有一定的時(shí)間和濃度依賴性。此外，在心臟成纖維細(xì)胞增殖的時(shí)效和量效實(shí)驗(yàn)中，SCAD的mRNA和蛋白表達(dá)均出現(xiàn)明顯下調(diào)，并且呈一定的時(shí)間和濃度依賴性。以上結(jié)果表明，SCAD表達(dá)下調(diào)可能與Ang II 誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞增殖密切相關(guān)。

為了進(jìn)一步明確SCAD與心臟成纖維細(xì)胞增殖和膠原表達(dá)的關(guān)系，我們采用RNA干擾技術(shù)，觀察到siRNA沉默心臟成纖維細(xì)胞SCAD基因的同時(shí)，心臟成纖維細(xì)胞出現(xiàn)明顯增殖，膠原含量及其表達(dá)明顯增加，與Ang II誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞的趨勢(shì)一致，SCAD表達(dá)下調(diào)直接促進(jìn)了心臟成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成，表明SCAD表達(dá)下調(diào)在心肌纖維化中可能具有重要作用。此外，siRNA在引起心臟成纖維細(xì)胞SCAD表達(dá)下調(diào)的同時(shí)，SCAD酶活性也明顯下降，脂肪酸β氧化速率減小，ATP生成減少，游離脂肪酸含量顯著升高，與Ang II引起心臟成纖維細(xì)胞脂肪酸代謝的變化一致。表明SCAD的表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致了心臟成纖維細(xì)胞脂質(zhì)代謝障礙。以上結(jié)果提示，SCAD的表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致了心臟成纖維細(xì)胞脂肪酸 β 氧化能力下降，從而引起ATP生成減少，游離脂肪酸含量增加，導(dǎo)致心臟成纖維細(xì)胞增殖及膠原表達(dá)增加。

綜上所述，SCAD在心臟成纖維細(xì)胞增殖和膠原表達(dá)中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，為我們進(jìn)一步研究SCAD在心肌纖維化中的作用奠定了基礎(chǔ)。然而，SCAD在心肌纖維化中的具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effects of short-chain acyl-CoA dehydrogenase on collagen expression and proliferation of rat cardiac fibroblasts

SHU Zhao-hui1, ZENG Zhen-hua1, HUANG Qiu-ju1, LI Zhong-hong1, LIU Pei-qing2, CHEN Shao-rui2, LAN Tian1, ZANG Lin-quan1, ZHOU Si-gui1

(1DepartmentofClinicalPharmacy,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China;2DepartmentofPharmacologyandToxicology,SchoolofPharmaceuticalSciences,SunYat-senUniversity,Guangzhou510006,China.E-mail:zhousg201014@163.com)

AIM: To investigate the effect of short-chain acyl-CoA dehydrogenase (SCAD) on collagen expression and proliferation of rat cardiac fibroblasts and to explore the relationship between SCAD and cardiac fibrosis. METHODS: The model of proliferation and collagen expression of rat cardiac fibroblasts induced by angiotensin II was established. After treatment with siRNA-1186, the expression of SCAD at mRNA and protein levels, fatty acids beta oxidation rate, ATP, the enzyme activity of SCAD and free fatty acids in the rat cardiac fibroblasts were determined. RESULTS: The mRNA and protein expression of SCAD was decreased in the rat cardiac fibroblasts induced by angiotensin II compared with the control cells, and the expression of collagen I and collagen III was significantly upregulated. Compared with negative control group, SCAD expression and activity, fatty acid beta-oxidation rate and ATP significantly decreased in siRNA-1186 group, but the content of free fatty acids were obviously increased in the rat cardiac fibroblasts, and the expression of collagen I and collagen III was significantly up-regulated. CONCLUSION: The expression and synthesis disorder of collagen may be triggered by down-regulation of SCAD. SCAD may be a promising therapeutic target for myocardial fibrosis.

Short-chain acyl-CoA dehydrogenase; Cardiac fibroblasts; Myocardial fibrosis; Energy metabolism; Collagen

1000- 4718(2016)12- 2184- 08

2016- 04- 18

2016- 09- 13

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81000072；No. 81670239)；廣東省科技計(jì)劃(No. 2014A020212315)；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 2016A030313729)；廣東藥科大學(xué)“創(chuàng)新強(qiáng)校工程”研究生教育建設(shè)項(xiàng)目(No. 20140300)；廣東省“十二五”醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科，依托廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、藥科學(xué)院。

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.12.010

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