劉玉春 林士軍 葉建華 陽(yáng)書坤 張靜 陳雄 陳紹山

支氣管哮喘患者白三烯受體1基因MicroRNA的表達(dá)

劉玉春 林士軍 葉建華 陽(yáng)書坤 張靜 陳雄 陳紹山

目的 探討支氣管哮喘患者外周血細(xì)胞白三烯受體-1（CysLTR1）基因MicroRNA的表達(dá)及臨床意義。方法 選擇支氣管哮喘急性發(fā)作患者17例（哮喘發(fā)作組）、支氣管哮喘診斷明確且臨床癥狀完全緩解3個(gè)月以上患者15例（哮喘緩解組）和健康體檢者20例（正常對(duì)照組），采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)外周血細(xì)胞CysLTR1基因MicroRNA的表達(dá)，并比較分析3組檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果CysLTR1基因MicroRNA在正常對(duì)照人群和支氣管哮喘患者中均有表達(dá)，但表達(dá)水平不同：哮喘發(fā)作組、哮喘緩解組和正常對(duì)照組CysLTR1/GAPDH分別為2.4059±0.1983、2.1800±0.2210和1.2300±0.1174，與正常對(duì)照組相比，哮喘發(fā)作組和哮喘緩解組CysLTR1基因MicroRNA的表達(dá)均明顯增高（均P＜0.05）；哮喘發(fā)作組與哮喘緩解組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 哮喘患者CysLTR1基因MicroRNA高表達(dá)可能與哮喘發(fā)生或急性發(fā)作相關(guān)。

支氣管哮喘 白三烯受體-1 MicroRNA

支氣管哮喘（哮喘）是一種由多種炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、多種細(xì)胞因子參與所致的氣道慢性炎癥性疾??；臨床上突出表現(xiàn)為氣道高反應(yīng)性，特別是氣道可逆性阻塞、發(fā)作性的呼氣性呼吸困難。近年來(lái)我國(guó)哮喘的發(fā)病率和病死率有逐年上升的趨勢(shì)。因此，有效控制哮喘發(fā)作，改善哮喘患者生活質(zhì)量是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。目前哮喘發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，值得臨床工作者深入探究哮喘患者外周血細(xì)胞白三烯受體-1（CysLTR1）基因MicroRNA表達(dá)，探討CysLTR1基因與哮喘的關(guān)系，以期進(jìn)一步探索哮喘的發(fā)病機(jī)制。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選擇2006年9月至2007年12月本院收治的支氣管哮喘急性發(fā)作患者17例（哮喘發(fā)作組），其中男7例，女10例，年齡15～52歲；支氣管哮喘診斷明確且臨床癥狀完全緩解3個(gè)月以上的患者15例（哮喘緩解組），其中男6例，女9例，年齡14～49歲；同期健康體檢者20例，其中男、女各10例，年齡15～50歲（正常對(duì)照組）。診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸分會(huì)2002年制定的《支氣管哮喘防治指南》[1]。哮喘發(fā)作組與哮喘緩解組患者是否用藥治療無(wú)限定，但排除患有嚴(yán)重肝、腎、心、腦、血液系統(tǒng)疾病者，以及免疫異常者和腫瘤患者；正常對(duì)照組均無(wú)其他呼吸系統(tǒng)疾病，無(wú)家族過(guò)敏史，無(wú)鼻炎等過(guò)敏性疾病。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 抽取空腹靜脈血5ml，提取外周血淋巴細(xì)胞。提取步驟嚴(yán)格防控核糖核酸酶（RNase）的污染。

1.2.2 材料與試劑 試劑Human total RNA（美國(guó)Zyagen公司，50μg）、Trizol（美國(guó)Invitrogen公司，100ml）購(gòu)于黑龍江廣泰醫(yī)療科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄酶等試劑購(gòu)于哈爾濱市新弘博實(shí)驗(yàn)儀器經(jīng)銷部（中國(guó)寶生物工程有限公司100 reactions BK4001）；實(shí)驗(yàn)所用引物購(gòu)于哈爾濱無(wú)限峰科技有限公司（中國(guó)生工生物工程有限公司），序列如下：CysLTR1上游引物：5-ATGACAGCCATGAGCTTTTTC-3，下游引物：5-CATTCTAAGGACAGAATCAA3_。

1.2.3 檢測(cè)方法 使用PROMAGE反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，將擴(kuò)增終產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖電泳。選用GAPDH作為內(nèi)參，大小在200bp。使用電泳凝膠定位呈像分析儀（上海天能科技有限公司，型號(hào)：Tanon 2500R）對(duì)電泳后的凝膠進(jìn)行不同程度的曝光攝影，采用1D凝膠分析軟件對(duì)電泳呈像結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)化分析，得到CysLTR1和對(duì)照樣品的GAPDH量的比值，即CysLTR1/ GAPDH。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)參對(duì)照電泳結(jié)果 正常對(duì)照組與哮喘組（包括急性發(fā)作、緩解患者）CysLTR1基因 MicroRNA的GAPDH表現(xiàn)完全一致。出現(xiàn)GAPDH說(shuō)明檢測(cè)的細(xì)胞數(shù)目基本一致，無(wú)技術(shù)操作錯(cuò)誤，反應(yīng)體系正常，見圖1。

圖1 對(duì)照組與哮喘組CysLTR1基因MicroRNA內(nèi)參對(duì)照電泳圖

2.2 正常對(duì)照組與哮喘組CysLTR1基因MicroRNA表達(dá) 將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖電泳，1～6電泳道為哮喘組，7～12電泳道為正常對(duì)照組，GAPDH條帶在200bp，CysLTR1條帶位于470bp，見圖2。

圖2 對(duì)照組與哮喘組的CysLTR1基因MicroRNA表達(dá)

以GAPDH為內(nèi)參對(duì)照，對(duì)待測(cè)產(chǎn)物進(jìn)行半定量分析。CysLTR1基因MicroRNA在正常對(duì)照人群、支氣管哮喘緩解患者和支氣管哮喘急性發(fā)作患者中均有表達(dá)，但表達(dá)水平不同：哮喘發(fā)作組、哮喘緩解組和正常對(duì)照組 CysLTR1/GAPDH分別為 2.4059±0.1983、2.1800± 0.2210和1.2300±0.1174。與正常對(duì)照組相比，哮喘發(fā)作組和哮喘緩解組CysLTR1基因MicroRNA表達(dá)均明顯增高（均P＜0.05）；哮喘發(fā)作組與哮喘緩解組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)人類支氣管黏膜的中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞等炎性細(xì)胞CysLTR1基因均有表達(dá)[2]，肺的結(jié)構(gòu)細(xì)胞平滑肌細(xì)胞CysLTR1基因也有明顯表達(dá)，其他肺結(jié)構(gòu)細(xì)胞表達(dá)不明顯。外周血嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和CD34+前粒細(xì)胞均檢測(cè)到CysLTR1 MicroRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，且受CysLTs、Th2等多種細(xì)胞因子的影響[3-4]。主要表現(xiàn)是CysLTs與靶細(xì)胞表面的CysLTR1結(jié)合，導(dǎo)致G蛋白下游Gq激活，促使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，引起CysLTR1 MicroRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平上調(diào)，從而產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)[5]。Th2型細(xì)胞因子中的IL-4、IL-5、IL-9、IL-13和IFN-γ等影響不同靶細(xì)胞表面的CysLTR1表達(dá)增多而產(chǎn)生不同效應(yīng)。Fujii等[6]比較正常人群與哮喘患者外周血CysLTR1基因MicroRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)急性發(fā)作哮喘患者的嗜酸性粒細(xì)胞CysLTR1表達(dá)水平明顯高于病情穩(wěn)定患者，較正常對(duì)照者的表達(dá)量也明顯增高。Amarani等[7]研究發(fā)現(xiàn)IFN-γ能上調(diào)人氣道平滑肌細(xì)胞表面CysLTR1表達(dá)水平，且該表達(dá)水平高低與IFN-γ呈劑量依存關(guān)系。說(shuō)明支氣管哮喘患者氣道IFN-γ濃度增高，從而作用于氣道平滑肌，使細(xì)胞表面CysLTR1表達(dá)增多，最終導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性和支氣管哮喘的急性發(fā)作。

本次研究結(jié)果表明，CysLTR1基因MicroRNA在正常人群、支氣管哮喘緩解和急性發(fā)作患者中均有所表達(dá)，但表達(dá)水平不同：哮喘發(fā)作組和哮喘緩解組均明顯高于正常對(duì)照組，而哮喘發(fā)作組與哮喘緩解組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與Zhu等[2]研究結(jié)果相似。以上說(shuō)明CysLTR1基因MicroRNA高表達(dá)可能與哮喘發(fā)生或急性發(fā)作相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)HL60細(xì)胞分化成顆粒細(xì)胞后，其細(xì)胞內(nèi)LTC4合成酶表達(dá)和CysLTs生成增加[8]，細(xì)胞膜表面的CysLT1受體表達(dá)水平隨之增加，對(duì)CysLTs的反應(yīng)明顯增強(qiáng)。孟魯司特是CysLTR1受體選擇性拮抗劑，能夠抑制嗜酸粒細(xì)胞的分化成熟；MK-571也是CysLTR1受體選擇性拮抗劑，能抑制17-β-雌三醇誘導(dǎo)原始粒細(xì)胞向粒細(xì)胞的分化，也能抑制LTD4劑量依賴性誘導(dǎo)粒細(xì)胞的終末分化；這說(shuō)明CysLTs及其受體參與細(xì)胞的分化，證明了CysLTR1在哮喘發(fā)生、發(fā)展中的重要作用。

[1] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病分會(huì)哮喘學(xué)組.支氣管哮喘防治指南（支氣管哮喘的定義、診斷、治療及教育和管理方案）[J].中華結(jié)核和呼吸病雜志, 2003,26(3):132-138.

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Expression of cysteinyl leukotrienes receptor 1 MicroRNA in PBMC of patients with asthma

LIU Yuchun,LIN Shijun,YE Jianhua,et al. Department of Respiratory Medicine,Longgang People's Hospital of Shenzhen,Shenzhen 518172,China

Objective To investigate the expression ofcysteinylleukotrienes receptor 1(CysLTR1)MicroRNA in peripheral blood mononuclear cell(PBMC)ofpatients with asthma. Methods Seventeen patient with asthma of acute attack,15 patients with remission stage of asthma and 20 healthy individuals were enrolled in the study.CysLTR1 MicroRNA in PBMC was detected by RT-PCR. Results The expression of CysLTR1 MicroRNA was significantly higher in patients with asthma of acute attacks and with remission than in controls(CysLTR1/GAPDH 2.4059±0.1983 and 2.1800±0.2210 vs 1.2300±0.1174,P＜0.05).But there was no significant difference between patients with acute attacks and those with remission (P＞0.05). Conclusion The up-regulated CysLTR1 MicroRNAin PBMC ofasthma patients may be associated with occurrence or acute attack ofthe disease.

Asthma Cysteinylleukotrienes receptor 1 MicroRNA

2015-04-27）

（本文編輯：陳丹）

518172 深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科

林士軍，E-mail：linsj100@126.com