易妙，喻京生，龍輝

祛風活血丸對EAU大鼠模型Fas/FasL表達的影響

易妙1，喻京生2，龍輝1

目的探討祛風活血丸對實驗性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）大鼠血清Fas、FasL水平的影響。方法將70只Lewis大鼠隨機分為空白組（A組），模型對照組（B組），陽性對照組（C組），以及祛風活血丸低、中、高劑量組（D、E、F組）。采用大鼠右后足墊注射含IRBP（光感受器間維生素A類結合蛋白）的PBS溶液+完全弗氏佐劑制作EAU模型，A組大鼠注射無菌生理鹽水。造模后各組大鼠灌胃給藥，A、B組予生理鹽水，C組予熊膽開明片，D、E、F組分別予低、中、高劑量的祛風活血丸。觀察大鼠眼部情況變化，并采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法檢測給藥后第7天、14天、21天、28天時各組大鼠的Fas、FasL血清濃度。結果1.成功誘發(fā)Lewis大鼠的EAU模型，在免疫后不同時間發(fā)生臨床可見的炎癥，造模成功率91.7%（55/60），空白組大鼠無臨床可見葡萄膜炎表現(xiàn)。2.空白組各時間點的Fas、FasL血清濃度始終位于較低水平，模型對照組各時間點的Fas、FasL水平均為最高，明顯高于空白組（P＜0.01），并有隨時間延長逐漸下降的趨勢。中、高劑量組各時間點的Fas、FasL水平較為接近，低于同期低劑量組及陽性對照組，與模型組比較下降更為明顯（P＜0.05）。結論Fas/FasL介導的細胞凋亡對EAU發(fā)病具有重要意義，祛風活血丸能使大鼠血清中Fas、FasL含量明顯降低。

祛風活血丸；實驗性自身免疫性葡萄膜炎；Fas；FasL；細胞凋亡

葡萄膜炎又稱為色素膜炎，是世界重要致盲眼病之一，指發(fā)生于葡萄膜、視網膜、視網膜血管及玻璃體的一組炎癥性疾病。葡萄膜炎的發(fā)病機制目前尚不明確，已知與感染、外傷、遺傳、自身免疫反應等因素有關。其中針對人類葡萄膜炎的研究傾向于將內因性葡萄膜炎定義為自身免疫性疾病〔1〕。鑒于此病的特殊性，近年來常用實驗性自身免疫性葡萄炎（experimental autoimmune uveoretinitis，EAU）模型作為常用的葡萄膜炎動物模型，由于其特征和臨床表現(xiàn)與人類葡萄膜炎的諸多相似之處，成為了研究葡萄膜炎發(fā)病機制的重要工具。

祛風活血丸為我院自制中成藥，具有祛風清熱，養(yǎng)血活血的作用。本研究擬利用EAU大鼠模型，以血清Fas、FasL為指標，觀察祛風活血丸對Fas/FasL系統(tǒng)的免疫調節(jié)作用的影響，以探討該藥防治葡萄膜炎的機制，為該藥的臨床應用提供理論依據(jù)，具體報告如下。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物及分組健康6~8周齡，體質量150~180 g的Lewis大鼠70只，雌雄各半，經檢查健康無眼疾（均由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供）。采用隨機數(shù)字表法將實驗動物分為空白對照組10只和EAU模型組60只，將造模成功的55只大鼠，留出5只作為補充組，其余50只大鼠重新采用隨機數(shù)字法分為5組，包括空白對照組共分為6組，每組10只，分別為：空白組，模型對照組，陽性對照組，以及祛風活血丸低劑量組、中劑量組、高劑量組。

1.1.2實驗試劑光感受器間維生素A類結合蛋白（interphotoreeeptor retinoid-binding protein，IRBP）多肽片斷（上海生工生物工程股份有限公司合成）、PBS溶液（北京索來寶科技有限公司）、弗氏完全佐劑（美國Sigma公司）。ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）、水合氯醛、4%多聚甲醛（美國Biosharp）。

1.1.3實驗用藥（1）祛風活血丸：由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥劑科提供。藥物配比為熟地黃20g、當歸15 g、川芎6 g、柴胡10 g、黃芩10 g、菊花10 g、防風10 g、魚腥草20 g。以粉碎機粉碎，并由我校制劑室加工成1 g/ml的懸浮液，置于4℃冰箱中保存。（2）熊膽開明片：吉林長白山藥業(yè)集團股份有限公司，主要成分為熊膽粉、石決明、菊花、枸杞子、澤瀉、茺蔚子、龍膽，每片含藥量0.35 g。

1.2實驗方法

1.2.1動物模型的制作參照文獻〔2〕方法制作EAU大鼠模型。以1 mg IRBP粉劑與1 ml PBS混合調制成濃度為1 mg/ml的含IRBP的PBS溶液，放置備用。以5 ml注射器連通三通閥，分別注入0.6 ml含IRBP的PBS溶液、1.4 ml單純PBS溶液，2 ml完全弗氏佐劑，反復推注直到充分乳化，制成4 ml混合乳劑。實驗組每只大鼠于右后足墊中部皮下進針，緩慢推注0.2 ml的混合乳劑1次，空白組大鼠右后足墊注射等劑量無菌生理鹽水1次。每天同一時段在裂隙燈下觀察大鼠眼前節(jié)改變，詳細記錄。以出現(xiàn)結膜充血水腫、角膜緣血管充血、虹膜血管擴張、前房滲出、晶狀體前囊有灰白色絮狀沉著物、虹膜后粘連、瞳孔膜閉以及玻璃體混濁等癥狀的大鼠作為EAU模型大鼠。

1.2.2分組給藥根據(jù)Meeh-Rubner公式，即A（體表面積m2）=K×W（2/3）/10 000（K：大鼠常數(shù)9.1；人常數(shù)10.6；W：體質量，g），推算出大鼠的體表面積，換算出相當于成人等效的治療劑量。造模后第7天開始給藥，空白組、模型對照組以生理鹽水4 ml灌胃；低劑量組、中劑量組、高劑量組分別以祛風活血丸2 g/（kg·d）、3 g/（kg·d）、4 g/（kg·d）灌胃；陽性對照組以熊膽開明片0.5 g/（kg·d）灌胃，每日2次。

1.2.3取材及檢測于給藥后第7天、14天、21天、28天分批處死動物，每組處死2只。每組剩余2只大鼠于第30天以內毒素誘發(fā)復發(fā)葡萄膜炎后處死。將大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后取其靜脈血，所有血標本儲存于真空采血管中，以3000 r/min離心15 min后取其血清置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，標本無溶血及絮狀沉淀。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法檢測血清Fas、FasL濃度（具體測定方法參照說明書）。

1.3統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，各組不同時間Fas、FasL血清濃度比較采用重復測量資料的方差分析，同一時間組間總體差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1EAU模型表現(xiàn)

裂隙燈下每日觀察大鼠眼部，空白組無炎癥反應；EAU模型組造模后出現(xiàn)一系列炎癥反應，與葡萄膜炎一致。最早于造模后第4天觀察到炎癥反應，表現(xiàn)為角膜緣血管充血，虹膜血管輕度擴張（圖1）；于造模后第5天出現(xiàn)葡萄膜炎反應，表現(xiàn)為不同程度前房混濁及角膜后沉著物（KP），房水閃光（+），瞳孔縮小，紅光反射減弱，部分出現(xiàn)晶狀體前灰白色絮狀物；于造模后第14天炎癥達到高峰，開始出現(xiàn)瞳孔緣灰白色絮狀物，前房變淺，房水混濁，角膜后KP，瞳孔膜閉等體征（圖2）。注射的60只大鼠共有55只出現(xiàn)不同程度的葡萄膜炎反應，造模成功率為91.7%。2.2Fas血清濃度變化

圖1 EAU模型大鼠裂隙燈像。1A.造模第4天眼部炎癥情況；1B.造模第14天眼部炎癥情況EAU：實驗性自身免疫性葡萄炎

不同組大鼠的血清Fas濃度以及各組大鼠整體上不同時間的血清Fas濃度均存在統(tǒng)計學意義的差異（重復測量資料的方差分析，F(xiàn)分組=12.770，P= 0.004；F時間=34.246，P＜0.001；F交互作用=1.663，P= 0.151）?？瞻捉M各時間點的Fas血清濃度始終位于較低水平，模型組各時間點的Fas水平均為最高，明顯高于空白組（P＜0.01），并有隨時間延長逐漸下降的趨勢。其余各組各時間點血清Fas濃度低于模型組，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義的包括：陽性對照組給藥后第14天（P=0.004）、第21天（P=0.025）、第28天（P=0.002）；低劑量組給藥后第14天（P= 0.001）、第28天（P=0.003）；中劑量組給藥后第7天（P=0.042）、第14天（P=0.000）、第21天（P=0.001）、第28天（P=0.000）；高劑量組給藥后第14天（P= 0.000）、第21天（P=0.001）、第28天（P=0.001）。與陽性對照組比較差異有統(tǒng)計學意義的包括：中劑量組給藥后第14天（P=0.004）、第21天（P=0.015）；高劑量組給藥后第14天（P=0.007）、第21天（P=0.024）；與低劑量組比較差異有統(tǒng)計學意義的包括：中劑量組給藥后第14天（P=0.015）、第21天（P=0.008）；高劑量組給藥后第14天（P=0.032）、第21天（P= 0.012）?？傮w上，中、高劑量組各時間點的Fas水平較為接近，低于同期低劑量組及陽性對照組；中劑量組各時間點數(shù)值低于高劑量組，但兩組間差異不大（P＞0.05）（表1，圖2）。提示祛風活血丸可以減少EAU大鼠血清中Fas的表達，且以中、高劑量組最為明顯。

2.3FasL血清濃度變化

圖2 各組大鼠給藥后不同時間血清Fas濃度（ng/ml）的變化情況

表1 各組大鼠給藥后不同時間血清Fas濃度變化情況（x±s，ng/ml）

各組大鼠不同時間的血清FasL濃度總體差異不同（重復測量資料的方差分析，F(xiàn)分組=73.455，P＜0.001；F時間=84.876，P＜0.001；F交互作用=6.587，P＜0.001）?？瞻捉M的FasL血清濃度始終較低，模型組FasL血清水平最高，兩組各時間點的差異明顯，統(tǒng)計學比較均有意義（P＜0.01）。與陽性對照組比較差異有統(tǒng)計學意義的包括：低劑量組給藥后第7天（P=0.009）；中劑量組給藥后第7天（P＜0.001）、第14天（P＜0.001）、第21天（P=0.004）、第28天（P= 0.002）；高劑量組給藥后第7天（P=0.001）、第14天（P=0.001）、第21天（P=0.003）、第28天（P=0.001）；與低劑量組比較差異有統(tǒng)計學意義的包括：中劑量組給藥后第7天（P=0.004）、第14天（P=0.002）、第21天（P=0.018）、第28天（P=0.014）；高劑量組給藥后第7天（P=0.028）、第14天（P=0.005）、第21天（P=0.010）、第28天（P=0.007）（表2，圖3）。提示祛風活血丸亦可減少EAU大鼠血清中FasL的表達，中、高劑量組的藥效最為明顯。

表2 各組大鼠給藥后不同時間血清FasL濃度變化情況（x±s，ng/ml）

圖3 各組大鼠給藥后不同時間血清FasL濃度（ng/ml）的變化情況

3 討論

葡萄膜炎多發(fā)生于青壯年，易合并全身性自身免疫性疾病，常反復發(fā)作，可引起一些嚴重并發(fā)癥甚至致盲。葡萄膜炎分類方法繁多，可以分為感染性和非感染性兩大類，除開感染性因素之外，目前認為，葡萄膜的發(fā)病主要與免疫相關〔3〕。EAU是研究人類葡萄膜炎乃至全身自身免疫性疾病的一種實驗動物模型，其模型表現(xiàn)特征性強，可重復，易于觀察與記錄，是藥物治療評估的理想模型〔4〕。本實驗證明IRBP能在Lewis大鼠上成功誘發(fā)葡萄膜炎，累及角膜、虹膜、睫狀體等部位，出現(xiàn)一系列的炎癥反應，并且隨著時間的推移，炎癥愈發(fā)加重，所以本研究制作的EAU模型是成功的。

大多數(shù)葡萄膜炎是由于自身抗原突破血-眼屏障，打破視網膜的免疫特赦所致。這些自身抗原被T細胞接收，從而引起針對自身抗原的免疫反應〔5〕，已經證實T細胞表面Fas/FasL表達的平衡性與葡萄膜炎的發(fā)病有關。Fas抗原又稱Apo-1 CD95，屬于TNF（腫瘤壞死因子）/NGF（神經生長因子）受體超家族成員，F(xiàn)asL是Fas在人體內的天然配體，可與Fas特異性結合，也屬于TNF/NGF超家族成員。二者結合向細胞內傳導死亡信號，誘導激活的T淋巴細胞凋亡。有研究表明，EAU過程中有大量炎癥細胞凋亡，眼組織中浸潤細胞的凋亡可能是標志EAU開始消退的最初征象之一。楊培增等〔6〕發(fā)現(xiàn)在EAU中，虹膜、睫狀體、視網膜、脈絡膜上不僅發(fā)生炎癥反應，也出現(xiàn)炎癥細胞的凋亡，推測此炎癥之所以迅速消退，可能與浸潤的炎癥細胞快速凋亡有關。在本實驗研究中發(fā)現(xiàn)無論是空白組還是藥物干預組均可見到Fas、FasL的表達，但是模型組的Fas、FasL表達明顯高于空白組，且隨著炎癥的高峰期到來也表達增多，經過藥物干預后，各藥物組Fas、FasL出現(xiàn)不同程度下降，其中以祛風活血丸中、高劑量組最為明顯。同時，模型組中亦可見到Fas、FasL也呈下降趨勢。因此，我們認為，EAU模型屬于T細胞介導的器官特異性自身免疫病，在這個過程中炎癥細胞釋放大量炎癥因子，從而刺激眼內組織中Fas表達，與配體FasL相結合誘導細胞發(fā)生凋亡，從而破壞正常組織結構。隨著炎癥高峰期到來，F(xiàn)as、FasL表達增多，與炎癥反應呈正相關，但伴隨著時間延長，有自行下降的傾向，且藥物組與模型組相比較，F(xiàn)as、FasL表達的下降幅度更明顯，這表明藥物干預加快了Fas、FasL下降的速度，加速了炎癥消退時間，從而達到治療效果，這可能與其促進細胞凋亡相關。

葡萄膜炎多見風熱外襲。肝開竅于目，肝主疏泄，若情志不暢，則肝氣郁結，郁而化火，火熱之邪上擾于目；風為陽邪，“傷于風者，上先受之”，目居于上位，易受風邪侵襲。風邪易挾它邪，熱邪亦屬陽邪，同氣相求，故風熱之邪常合而侵襲眼目。同時考慮到葡萄膜多氣多血，炎癥時易造成局部瘀滯，因此氣滯血瘀為其常見的病理改變，基本病機為外感風熱，氣滯血瘀。陽性對照組選用中成藥熊膽開明片，各藥配伍，具有清肝泄熱，滋陰明目的作用，研究顯示熊膽開明片對白內障術后并發(fā)癥及急性虹膜睫狀體炎具有很好地療效〔7-9〕。治療組藥物選用湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院院內制劑祛風活血丸，主要組成為熟地黃、當歸、川芎、柴胡、黃芩、菊花、防風、魚腥草等。方中熟地黃滋陰補血，當歸養(yǎng)血和血，川芎行血活血，熟地黃乃血中之血藥，當歸、川芎為血中之氣藥，可收補而不滯之效；黃芩、魚腥草清熱解毒；柴胡疏肝解郁；菊花清肝明目；防風祛風止痛；藥少功強，共奏祛風清熱、行氣活血之功效。在前期研究中，李維等〔10〕發(fā)現(xiàn)祛風活血丸能夠明顯降低白內障術后遲發(fā)型葡萄膜炎的發(fā)生率，且能緩解眼局部癥狀；肖霞等〔11〕在西醫(yī)基礎上加用祛風活血丸治療葡萄膜炎，發(fā)現(xiàn)中西結合療效佳；曾靜等〔12〕對祛風活血丸治療前葡萄膜炎療效觀察，結果顯示該藥既能提高療效，又能減少復發(fā)，值得推廣應用。故本實驗選用祛風活血丸對EAU大鼠進行干預，實驗結果表明祛風活血丸可以減少實驗性自身免疫性葡萄膜炎Fas、FasL的表達，且以中、高劑量組的治療效果最好，我們因此推測祛風活血丸可通過調整Fas/FasL系統(tǒng)的平衡性，從而促進活化的淋巴細胞迅速凋亡，降低炎癥反應的程度。

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Functions of Huoxue Pill on EAU Rats Model of Fas/FasL Expression Effect

YI Miao，YU Jingsheng，LONG Hui.Hunan University of Traditional Chinese Medicine，Changsha 410208，Hunan，China

OBJECTIVEExplore the functions of huoxue pill on experimental autoimmune uveitis（EAU）serum level of Fas and FasL in rats.METHODS0 Lewis rats were randomly divided into blank group（group A），model control group（group B），positive control group（group C），as well as the functions of huoxue pill low，medium and high dose group（group D，E，F(xiàn)）.Using the right rear foot pad injection in rats including IRBP（vitamin A binding protein）between photoreceptor of PBS solution+make EAU model complete freund's adjuvant，group A sterile saline injection in rats.After building groups of rats lavage，A，B group with physiological saline，group C to bear bile enlightened，D，E，F(xiàn) group to low，medium and high doses of the functions of huoxue pellet.Observation rat eye situation changes，and using enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）method to detect drug delivery after 7 days，14 days，21 days，28 days between groups of Fas and FasL in rats serum concentration.RESULTS1.The EAU successfully induce Lewis rats model，clinical visible at different time before and after the immune inflammation，building success rate 91.7%（55/60），blank group rats without clinical visible uveitis.2.Each time point blank group serum concentrations of Fas and FasL always located in the lower level，model control group of each time point was the highest level of Fas and FasL，significantly higher than the blank group（P<0.01），and has a tendency to extend gradually decreases with time.Each point in time，the high dose group of Fas and FasL level is relatively close，lower than the same period and low dose group and positive control group，compared with model group decreased more significantly（P<0.05）.CONCLUSIONSFas/FasL mediated apoptosis of EAU incidence is of great significance and functions of huoxue pill can make the rats serum content of Fas and FasL decreased obviously.

functions of huoxue pill；experimental autoimmune uveitis；Fas；FasL；cell apoptosis

R285.5

：A

：1002-4379（2016）04-0226-05

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2016.04.005

國家自然科學基金項目（81273808/H2713）

1.湖南中醫(yī)藥大學（2014級碩士研究生），長沙410208

2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，長沙410007

喻京生，E-mail：yujingsheng-mike@163.com