丁宏武，彭彰文，彭珍珍，余兆碩，麻成金

（吉首大學(xué)食品科學(xué)研究所，湖南吉首 416000）

洗車河霉豆腐加工及優(yōu)良毛霉菌種的篩選

丁宏武，彭彰文，彭珍珍，余兆碩，*麻成金

（吉首大學(xué)食品科學(xué)研究所，湖南吉首 416000）

從洗車河霉豆腐中進(jìn)行毛霉菌種的篩選，得到3株優(yōu)勢(shì)菌株6，9，10號(hào)，其在28℃時(shí)生長(zhǎng)茂盛且菌絲顏色呈白色，產(chǎn)蛋白酶活力高，并在霉豆腐后發(fā)酵期積累了一定的糖化酶和脂肪酶；在菌株培養(yǎng)72 h后菌體開始老化，酶活力開始下降。

霉豆腐；加工工藝；篩選；酶活力

0 引言

腐乳（Sufu）又稱霉豆腐，是深受我國(guó)消費(fèi)者喜愛的一種傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品。腐乳不僅含有大豆本身所有的多種生理活性物質(zhì)，而且通過微生物發(fā)酵作用，將大豆的苦腥味、脹氣因子、抗?fàn)I養(yǎng)因子等不足之處全部克服，同時(shí)產(chǎn)生多種具有香味的有機(jī)酸、醇、酯、氨基酸，以及硫胺素、核黃素、尼克酸、鈣和磷等營(yíng)養(yǎng)成分[1]，并且不含膽固醇[2]。除此之外，腐乳含有的生理活性物質(zhì)具有一定保健功能，發(fā)酵產(chǎn)生的核黃素含量比豆腐中含量高6～7倍[3]。

對(duì)于湖南來說，湘西龍山縣洗車河霉豆腐當(dāng)數(shù)一絕。2003年7月，中央12頻道在《走玩湘西》節(jié)目中首次對(duì)其進(jìn)行了特別報(bào)道。自此，味美、清香、可口、醇厚成為了洗車河霉豆腐的代名詞。2007年11月，洗車河霉豆腐榮獲中國(guó)湖南第九屆（國(guó)際）農(nóng)博會(huì)金獎(jiǎng)，并已被列入湘西自治州非物質(zhì)文化遺產(chǎn)保護(hù)項(xiàng)目。

但是，洗車河霉豆腐仍采用傳統(tǒng)自然發(fā)酵的方式進(jìn)行生產(chǎn)，不僅嚴(yán)重制約了其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，同時(shí)也存在著許多雜菌毒素感染的安全隱患。試驗(yàn)挑選了洗車河霉豆腐發(fā)酵毛坯上的毛霉菌株進(jìn)行分離篩選，以期為大規(guī)模生產(chǎn)提供技術(shù)支持與品質(zhì)保障。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌種

龍山洗車河霉豆腐發(fā)酵毛坯上分離得到的菌株。

1.2 培養(yǎng)基

（1）馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基[4]。去皮馬鈴薯20 g，蔗糖2 g，瓊脂2 g，水100 mL，自然pH值，分裝，于121℃下滅菌30 min，備用。

（2）麩皮培養(yǎng)基。稱取麩皮90 g，水100 mL，自然pH值，適量裝入250 mL三角瓶中，于121℃下滅菌30 min，及時(shí)搖散，備用。

（3）斜面種子培養(yǎng)基。酵母膏7 g，磷酸二氫鉀1 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鈣0.5 g，硫酸鋅0.2 g，豆餅粉20 g，葡萄糖15 g，瓊脂10 g，pH值6.0，用蒸餾水煮沸溶解后定容至1 000 mL，分裝，于121℃下滅菌30 min，備用。

（4）酪蛋白（干酪素）瓊脂培養(yǎng)基。酪素的母液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，是將4 g干酪素溶解于30～35 mL 的0.1 mol/L NaOH水溶液中，水浴溶解20 min，待溶解完全后加入60～70℃熱水，稀釋到所需質(zhì)量分?jǐn)?shù)（即定容到100 mL），即得到母液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的酪素溶液。培養(yǎng)條件為pH值6.5～7.0，121℃，滅菌30 min（腐乳中毛霉菌株的初步篩選及其培菌期的生化變化）。

1.3 試驗(yàn)儀器

101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；HZFB200型電子天平，美國(guó)康州HZ電子有限公司產(chǎn)品；E-201-C型pH計(jì)，上海精科實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；WSL-2型比色計(jì)，上海昕瑞儀器儀表有限公司產(chǎn)品；YXQ-SG46-280S型手提式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊公司產(chǎn)品；HH-S2型恒溫水浴鍋，金壇市成輝儀器廠產(chǎn)品；KDN型系列自動(dòng)凱氏定氮儀，浙江托普儀器有限公司產(chǎn)品；SPX-250B型生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；VS-1300-U型超凈工作臺(tái)，上海喬躍電子有限公司產(chǎn)品。

1.4 工藝流程

新鮮豆腐→劃塊→豆腐坯→純種霉菌接種→培養(yǎng)→搓毛→食用鹽腌制→添加輔料后裝壇→后熟→成品。

1.4.1 前發(fā)酵操作要點(diǎn)

（1） 切塊。豆腐經(jīng)濾水后，切塊時(shí)要厚薄均勻、富有彈性，無氣泡現(xiàn)象，一般切成2 cm見方的塊狀。

（2）接種培養(yǎng)。將切好塊的豆腐以1～3 cm的間距擺放在籠格上，用噴霧器均勻地噴灑含有培養(yǎng)基培養(yǎng)的毛霉菌懸浮液，然后放置于發(fā)酵室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，溫度控制在20～25℃。在接種24 h后應(yīng)翻籠1次，調(diào)節(jié)上下溫差，補(bǔ)給空氣，使毛霉菌正常繁殖，以后間歇倒籠，以降低品溫，直至制曲成熟。

（3）搓毛。培養(yǎng)結(jié)束，長(zhǎng)滿菌絲的毛坯要及時(shí)搓毛。搓毛是將長(zhǎng)在豆腐坯表面的菌絲搓倒，使棉絮狀菌絲將豆腐坯包住，有利于保持產(chǎn)品的外形；同時(shí)，將塊與塊之間的菌絲搓斷，把連接的豆腐塊分開。

1.4.2 后發(fā)酵工藝

（1）腌坯。腌坯時(shí)，要分層加鹽，下層鹽少一些，向上逐層增加。其作用為使鹽分在豆腐中充分滲透，使菌絲與毛坯收縮，失水變硬，經(jīng)后發(fā)酵不松散，呈味且防腐，使其緩慢水解，防止腐乳靡爛。

（2）加輔料裝壇。添加香辛料、米酒、茶葉、食用油等輔料，裝壇時(shí)不可裝得過緊，否則發(fā)酵不完全，中間有夾心；也不能裝歪，以免影響產(chǎn)品外觀。

（3）封口。封口是最后一道工序，也是一個(gè)關(guān)鍵性工序。封口時(shí)，先選好合適的壇蓋，再以鹽水密封；要嚴(yán)防漏氣，漏氣使酒精蒸發(fā)，不僅易染雜菌，使腐乳發(fā)霉變質(zhì)，還會(huì)使霉豆腐風(fēng)味大打折扣。

1.5 測(cè)定方法

1.5.1 菌種的分離純化

將長(zhǎng)滿毛霉菌絲的腐乳坯制成1×10-1～1×10-6的菌懸液，并從1×10-3～1×10-6的稀釋液中取0.1 mL分別涂布到馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基上，且每個(gè)稀釋度做3次平行試驗(yàn)，于28℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)48 h，再選取生長(zhǎng)速度快、菌絲豐滿、表面顏色一致的毛霉單菌落，在選擇培養(yǎng)基上劃線分離，將透明圈最大的純種毛霉蛋白酶菌株接種到馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，待長(zhǎng)滿孢子后備用[5-6]。

1.5.2 菌種的活化

用接種環(huán)取分離出的毛霉菌株，接入新鮮的種子培養(yǎng)基中，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.5.3 菌種的初篩

采用透明光圈法，將菌懸液點(diǎn)接入酪蛋白培養(yǎng)基中，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后測(cè)定透明圈的直徑與菌落直徑的比值（Hc），以Hc值的大小比較蛋白酶活力的高低。

1.5.4 菌種的復(fù)篩

取0.5 mL菌懸液（孢子數(shù)為10個(gè)/mL），接入麩皮培養(yǎng)基中，搖勻后于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。取一定量的鮮曲，制備酸性、堿性及中性蛋白酶粗酶液后，測(cè)定其相應(yīng)蛋白酶的活力。

1.5.5 蛋白酶粗酶液的制備

取上述培養(yǎng)基中物質(zhì)放入錐形瓶中，加入100 mL無菌水，并搗碎培養(yǎng)物，同時(shí)分別加入20 mL的0.1 mol/L，pH值為2.6的乳酸-乳酸鈉緩沖液及0.1 mol/L，pH值為7.2的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液和0.05 mol/L，pH值為10.0的硼砂-氫氧化鈉緩沖液，在40℃水浴中浸提1 h，間斷攪拌，經(jīng)濾紙過濾后即得到相應(yīng)的酸性、中性和堿性蛋白酶粗酶液。

1.5.6 蛋白酶活力的測(cè)定

采用福林-酚法（SB/T 10317—1999），分別用相應(yīng)的pH值（2.6，7.2，10.0） 緩沖液配置酪蛋白溶液作底物，測(cè)定酸性、中性及堿性蛋白酶活力的高低。定義在40℃條件下，每1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需酶量為1個(gè)酶活單位。

1.5.7 樣品預(yù)處理

準(zhǔn)確稱取腐乳樣品25 g，研磨后溶于200 mL蒸餾水中，煮沸幾分鐘且在此期間不停攪拌，冷卻后定容至250 mL，靜置6 h，每30 min振蕩1次，最后用多層紗布過濾，得10%清液。

1.5.8 蛋白質(zhì)的測(cè)定

采用凱氏定氮法（GB 50095—2010），測(cè)定樣品可溶性蛋白質(zhì)時(shí)，取定量的樣品清液進(jìn)行測(cè)定。

1.5.9 氨基酸態(tài)氮的測(cè)定

采用甲醛滴定法（SB/T 10170—2007）測(cè)定。

1.5.10 總酸的測(cè)定

采用總酸度測(cè)定法（SB/T 10170—2007）測(cè)定。

2 結(jié)果分析

2.1 毛霉菌株的篩選

2.1.1 菌株的初篩

將龍山洗車河霉豆腐毛坯上發(fā)酵的毛霉菌株接種到選擇培養(yǎng)基上，于28℃下培養(yǎng)48 h，對(duì)目標(biāo)毛霉進(jìn)行多次分離純化，然后進(jìn)行初篩，選出10株左右合適的毛霉菌株。

將毛霉菌株培養(yǎng)后測(cè)定各個(gè)菌株的Hc值，然后根據(jù)Hc值的大小進(jìn)行篩選，從中選出6株菌種，在此基礎(chǔ)上再進(jìn)行下一步討論。

各菌株Hc值的比較見表1。

表1 各菌株Hc值的比較

由表1可知，1，2，3號(hào)的Hc值最低，4，7，9號(hào)的Hc值最高，其余的較一般。根據(jù)Hc值選擇4，6，7，8，9，10號(hào)。

2.1.2 毛霉菌株的復(fù)篩

將上述所選的毛酶菌株于28℃下進(jìn)行培養(yǎng)，定時(shí)觀察其生長(zhǎng)情況。包括菌絲的表面狀態(tài)、菌落的高度、長(zhǎng)勢(shì)以及菌落的顏色，根據(jù)其生長(zhǎng)情況來篩選出適合的毛霉菌種進(jìn)行培育，并經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后放于4～6℃進(jìn)行保存。

培養(yǎng)期毛霉菌株生長(zhǎng)情況的比較見表2。

根據(jù)表2可得，4，8號(hào)生長(zhǎng)速度緩慢菌絲低矮；而6，9，10號(hào)生長(zhǎng)速度較快且菌絲較高、長(zhǎng)勢(shì)也好，菌落顏色都是呈純白色；7號(hào)的生長(zhǎng)情況一般。故選擇6，9，10號(hào)作為優(yōu)良菌種進(jìn)行下一部分的出發(fā)菌種。

2.1.3 優(yōu)勢(shì)菌種小型生產(chǎn)試驗(yàn)

通過對(duì)照試驗(yàn)來驗(yàn)證所選出來的優(yōu)勢(shì)菌種效果，將優(yōu)勢(shì)菌種和原菌種各接種到腐乳毛坯上，于28℃下培養(yǎng)，觀察并比較毛霉的生長(zhǎng)情況，測(cè)定相應(yīng)的酶活力。

原菌種與優(yōu)勢(shì)菌種在腐乳上的培養(yǎng)情況見表3。

2.1.4 優(yōu)勢(shì)菌種培養(yǎng)期生理變化

（1）優(yōu)勢(shì)菌株蛋白酶作用最適pH值比較。

表2 培養(yǎng)期毛霉菌株生長(zhǎng)情況的比較

表3 原菌種與優(yōu)勢(shì)菌種在腐乳上的培養(yǎng)情況

優(yōu)勢(shì)菌種在酸性、中性和堿性條件下蛋白酶活力比較見圖1。

圖1 優(yōu)勢(shì)菌種在酸性、中性和堿性條件下蛋白酶活力比較

由圖1可知，優(yōu)勢(shì)菌種均以產(chǎn)中性蛋白酶為主，蛋白酶作用最適pH值為9.0左右。

（2）優(yōu)勢(shì)菌株在培養(yǎng)期各酶活力比較。

圖2 不同培養(yǎng)期6，9，10號(hào)蛋白酶活力

不同培養(yǎng)期6，9，10號(hào)蛋白酶活力見圖2。

由圖2可知，9號(hào)產(chǎn)蛋白酶能力較其他2個(gè)菌株高，且3個(gè)菌株在72 h產(chǎn)酶能力達(dá)到最高，隨后隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加有所降低。

2.2 優(yōu)勢(shì)菌種培養(yǎng)期豆腐坯的主要變化

6 號(hào)菌株培養(yǎng)期豆腐坯變化見圖3，9號(hào)菌株培養(yǎng)期豆腐坯變化見圖4，10號(hào)菌株培養(yǎng)期豆腐坯變化見圖5。

圖3 6號(hào)菌株培養(yǎng)期豆腐坯變化

圖4 9號(hào)菌株培養(yǎng)期豆腐坯變化

由圖3～圖5可知，在接種12 h左右后豆腐坯中的水溶性蛋白質(zhì)含量、氨基酸態(tài)氮以及總酸隨之增加，且在24 h左右酶活力達(dá)到高峰，但在48 h左右酶活力有所下降，水溶性蛋白質(zhì)含量、氨基酸態(tài)氮含量以及總酸含量增長(zhǎng)也隨之減緩。

圖5 10號(hào)菌株培養(yǎng)期豆腐坯變化

3 結(jié)論

從湖南龍山洗車河霉豆腐中分離得到的毛霉菌種，經(jīng)篩選后得到3株優(yōu)勢(shì)菌株6，9，10號(hào)。6，9，10號(hào)生長(zhǎng)速度快，菌絲高度可達(dá)12 mm，且長(zhǎng)勢(shì)茂密，顏色都呈純白色，最后選擇以上3個(gè)菌株作為優(yōu)勢(shì)菌種進(jìn)行豆腐坯試驗(yàn)。

通過培養(yǎng)期的試驗(yàn)和豆腐坯試驗(yàn)的綜合研究，優(yōu)勢(shì)菌株培養(yǎng)60 h左右在豆腐坯表面積累了大量的蛋白酶以及一定量的糖化酶和脂肪酶，在72 h后菌體開始出現(xiàn)老化現(xiàn)象，故其酶活力出現(xiàn)下降趨勢(shì)。試驗(yàn)對(duì)洗車河霉豆腐中的優(yōu)勢(shì)菌種進(jìn)行了較好的篩選，便于后續(xù)低鹽優(yōu)質(zhì)霉豆腐的產(chǎn)品生產(chǎn)。

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Processing Technology and Screening of Elite Strain for Sufu in Xichehe

DING Hongwu，PENG Zhangwen，PENG Zhenzhen，YU Zhaoshuo，*MA Chengjin （Institute of Food Science，Jishou University，Jishou，Hu'nan 416000，China）

The experiment screenes three target strains from natural fermentation microorganism of Xichehe Sufu which are NO.6，NO.9 and NO.10.Under temperature of 28℃，the mycelia are prosperous with white color，producing high-active protease.The three strains accumulate a large number of saccharifying enzyme，lipase during cultivation，but after 72 hours，thalli become old with enzyme activity declining.

Sufu；processing technology；screening；enzymatic activity

TS214.2；TS201.3

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.11.038

1671-9646（2016）11b-0034-04

2016-09-08

吉首大學(xué)食品與生物類專業(yè)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練中心資助項(xiàng)目（JDCX2015-13）。

丁宏武（1993—），男，在讀本科，研究方向?yàn)槭称焚Y源加工與利用。

*通訊作者：麻成金（1963—），男，碩士，教授，研究方向?yàn)槭称焚Y源加工與利用。