余 鋒，徐 波，季 瀏

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α-分泌酶在自主運動調(diào)節(jié)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬APP與Aβ42中的作用研究

余 鋒1，徐 波2，季 瀏2

目的：探討α-分泌酶在16周自主跑輪運動調(diào)節(jié)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬APP水解與Aβ42生成中的作用。方法：24只C57系APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠，隨機分為自主跑輪運動組(TE，n=12)和對照組(TC，n=12)；同時選取C57系野生型小鼠24只，隨機分為自主跑輪運動組(E，n=12)和對照組(C，n=12)。TE組和E組小鼠從3月齡開始，除給予正常飲食、飲水外，給予16周的自主跑輪運動，TC組和C組小鼠給予正常飲食、飲水，不運動。采用實時熒光定量RT-PCR實驗檢測各組小鼠海馬α-分泌酶家族的3種主要成員ADAM9、ADAM10和ADAM17 mRNA表達水平，采用Western Blot實驗檢測各組小鼠海馬APP、ADAM10和Aβ42蛋白表達水平。結(jié)果：1)16周的自主跑輪運動極顯著性上調(diào)了APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬ADAM10 mRNA表達水平(P<0.01)，同時顯著性上調(diào)了轉(zhuǎn)基因小鼠海馬ADAM10蛋白表達水平(P<0.05)；2)16周的自主跑輪運動顯著上調(diào)了APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬ADAM17 mRNA表達水平(P<0.05)；3)16周的自主跑輪運動顯著性下調(diào)了APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬APP(P<0.05)和Aβ42(P<0.05)的蛋白表達水平。結(jié)論：16周的自主跑輪運動可通過促進APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬α-分泌酶基因表達進而降低轉(zhuǎn)基因小鼠海馬APP的水平，并抑制APP水解產(chǎn)生Aβ42的水平。

自主跑輪運動；阿爾茨海默??；APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠；海馬；α-分泌酶；β-淀粉樣前體蛋白；β-淀粉樣蛋白42

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種進行性記憶受損和認知功能下降的神經(jīng)退行性疾病。AD主要病理特征是腦內(nèi)β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)沉積、神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NTFs)，以及神經(jīng)細胞的減少和腦組織的萎縮等[7]。其中，神經(jīng)細胞外Aβ異常沉積形成老年斑是導致AD的主要原因之一。

腦內(nèi)Aβ多肽具有極其強烈的神經(jīng)毒性，能誘導腦組織的免疫炎癥反應、神經(jīng)細胞的異常凋亡、氧化應激損傷以及誘導鈣離子穩(wěn)態(tài)。其機理可能是Aβ易于和神經(jīng)細胞膜、小神經(jīng)膠質(zhì)細胞以及神經(jīng)細胞的相關(guān)受體結(jié)合，阻礙細胞膜的物質(zhì)運輸[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，外周血中的Aβ可穿越受損的血腦屏障，直接對神經(jīng)細胞產(chǎn)生毒性作用[19]。Song等[32]的研究顯示，納摩爾濃度的Aβ即可結(jié)合于神經(jīng)細胞膜上。Aβ的神經(jīng)毒性還可誘導活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生，研究發(fā)現(xiàn)，ROS可導致自由基增加，脂質(zhì)過氧化反應加劇，增強神經(jīng)細胞膜的通透性，導致鈣離子的大量內(nèi)流，激活鈣依賴性酶的反應，這一系列反應導致了神經(jīng)細胞物質(zhì)轉(zhuǎn)運相關(guān)代謝機制的紊亂，誘發(fā)神經(jīng)細胞的功能損害[11，16]。此外，Aβ還可誘導神經(jīng)細胞異常凋亡，誘導神經(jīng)細胞的缺失，有研究發(fā)現(xiàn)，Aβ可通過誘導促凋亡蛋白Bax的表達，導致神經(jīng)細胞的異常凋亡[28]。Aβ還可誘導神經(jīng)細胞的能量代謝障礙，Aβ可直接損害細胞膜，導致鈣離子內(nèi)流和鈣離子超載的發(fā)生，促使細胞內(nèi)線粒體腫脹，導致線粒體的能量供應系統(tǒng)功能紊亂[35]，致使神經(jīng)細胞異常死亡和神經(jīng)系統(tǒng)的退行性病變。

過去數(shù)十年中，研究者在AD的預防和治療領域展開了大量的研究。在體育科學領域，運動干預被證明可有效預防和緩解AD的發(fā)病。動物實驗證實，運動訓練在改善AD病理機制方面非常有效，主要體現(xiàn)在以下幾個方面：運動能夠誘導腦內(nèi)Aβ沉積水平的降低[5,20,25,26]，運動可抑制腦內(nèi)tau蛋白的異常磷酸化進程[6,23,24]，運動能夠促進神經(jīng)細胞的抗氧化功能[14,24,37]、緩解神經(jīng)細胞死亡的發(fā)生[18,33,34]和神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應的發(fā)生[17,26]等，這些均是降低AD風險的重要機制。因此，運動干預在AD病理調(diào)節(jié)中的作用值得進一步探討。本研究擬探討α-分泌酶在16周的自主跑輪運動調(diào)節(jié)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬APP水解及Aβ42生成中的作用，闡釋自主運動調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因小鼠海馬Aβ沉積的可能分子機制。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

購自南京大學-南京生物醫(yī)藥研究院實驗動物模式研究所的3 月齡C57系APPswe/ PSEN1dE9(APP/PS1)轉(zhuǎn)基因雄性小鼠24 只(體重19.56±1.48 g)和正常野生型C57系小鼠24 只(體重20.24±1.02 g)。各組小鼠每籠1只，獨立飼養(yǎng)。小鼠飼料購自上海斯萊康公司，給予其自由飲水和飲食飼養(yǎng)。環(huán)境溫度控制在22℃～24℃，相對濕度控制在50%～60%，自然光照。本實驗過程嚴格按照華東師范大學《實驗動物管理委員會章程》和《實驗動物倫理委員會章程》飼養(yǎng)和對待實驗小鼠。

1.2 研究方法

1.2.1 動物分組與運動方案

丹參多酚酸鹽聯(lián)合地爾硫卓治療不穩(wěn)定型心絞痛的療效及對血清基質(zhì)蛋白酶-9和髓過氧化物酶水平的影響……………………… 魏曉娟 常榮 李衛(wèi) 等（4）442

隨機將APP/PS1轉(zhuǎn)基因雄性小鼠24只分為自主跑輪運動組(TE，n=12)和對照組(TC，n=12)，隨機將野生型C57BL/6 小鼠24只也分為自主跑輪運動組(E，n=12)和對照組(C，n=12)。其中，TE 組和E 組小鼠除給予正常飲食和飲水之外，為其提供16周的自主跑輪運動，具體操作參考Adlard等[5]研究進行。通過安裝在籠蓋上的電子計數(shù)器記錄小鼠每天的跑輪圈數(shù)，根據(jù)跑輪的直徑計算跑輪的周長，再通過跑輪圈數(shù)與跑輪周長的乘積計算小鼠每天的跑動距離，作為小鼠每天的運動量參考值并統(tǒng)計運動組小鼠每4天的跑輪平均距離(圖1)。

圖1 本研究E組和TE組小鼠跑輪運動的平均距離折線圖Figure 1. The Average Running Distance of Group E and Group TE

1.2.2 實時定量RT-PCR 實驗

冰上取海馬組織約20 mg，按照Invitrogen Trizol法提取總RNA，采用Toyobo Fsq101反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA(15℃，5 min； 37℃，15 min；85℃， 5 min)，ABI Step One型實時熒光定量PCR儀檢測相關(guān)基因相對含量，熒光染料為Toyobo QPK201 SYBR GREEN。具體實驗操作步驟參照Yu等[37]研究進行。各目的基因和內(nèi)參基因的引物序列見表1(引物設計與合成均由上海生工生物工程有限公司提供合成服務)。

1.2.3 Western blot實驗

另取海馬組織約20 mg，冰上剪碎放入研磨管中，按照Beyotime P0013 Western及RAP裂解液說明書加入0.5 ml裂解液(含1 mM PMSF)，OMINI Bead Ruptor型磁珠勻漿機勻漿，14 000 g離心15 min，取上清轉(zhuǎn)入離心管，BCA法測定蛋白濃度后進行蛋白變性。采用8%分離膠電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜；使用5%脫脂奶粉封閉，一抗于4℃環(huán)境孵育12 h，TBST緩沖液清洗后，HRP標記的二抗于室溫孵育2 h，Millipore ECL超敏試劑盒顯影，Alpha FC2型凝膠成像系統(tǒng)進行冷光掃膜。實驗所用抗體購于CST和Abcam公司，使用Flour Chem FC2軟件對所捕捉圖像進行灰度值分析，具體實驗步驟參照LEEM等[24]的研究。

表1 RT-PCR實驗基因引物序列表(5’- 3’)一覽表Table 1 Gene Primer Sequences for Real-time RT-PCR (5’- 3’)

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 18.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件和GraphPad繪圖分析軟件以及Excel 2007辦公軟件分析實驗數(shù)據(jù)。所有實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為具有顯著性差異，P<0.01 為具有極顯著性差異。

2 實驗結(jié)果

本研究通過RT-PCR法檢測ADAMs(ADAM9、ADAM10和ADAM17) mRNA表達水平，通過Western blot法檢測了APP、ADAM10和Aβ42的蛋白表達水平。

2.1 各組小鼠海馬ADAMs mRNA表達水平的變化

實驗結(jié)果顯示，與C組小鼠相比，TC組小鼠海馬ADAM10 mRNA表達水平極顯著性上調(diào)(P<0.01)，ADAM17和ADAM9 mRNA表達水平均無顯著性差異；與TC組小鼠相比，TE組小鼠海馬ADAM10 mRNA表達水平呈現(xiàn)極顯著性上調(diào)(P<0.01)，ADAM17 mRNA表達水平亦顯著性上調(diào)(P<0.05)，ADAM9 mRNA表達水平較有上調(diào)趨勢，但不具有顯著性差異；與E組小鼠相比，TE組小鼠海馬ADAM10 mRNA表達水平顯著性下調(diào)(P<0.05)，ADAM17 mRNA表達水平呈現(xiàn)極顯著性下調(diào)(P<0.01)，ADAM9 mRNA表達水平不具有顯著性差異；與C組小鼠相比，E組小鼠海馬ADAM10 mRNA表達水平顯著性上調(diào)(P<0.05)，ADAM17 mRNA表達水平上調(diào)幅度具有極顯著性差異(P<0.01)，ADAM9 mRNA表達水平上調(diào)，但無顯著性差異(表2，圖2)。

表2 各組小鼠海馬ADAMs相對于GAPDH的mRNA表達水平一覽表Table 2 mRNA Expression of ADAMs to GAPDH in the Hippocampus of Four Groups

2.2 各組小鼠海馬ADAM10、APP和Aβ42蛋白表達水平的變化

實驗結(jié)果顯示，與C組小鼠相比，TC組小鼠海馬ADAM10蛋白表達水平顯著性下調(diào)(P<0.05)，APP蛋白、Aβ42蛋白表達水平極顯著性上調(diào)(P<0.01)；與TC組小鼠相比，TE組小鼠海馬ADAM10的蛋白表達水平顯著性上調(diào)(P<0.05)，APP蛋白、Aβ42蛋白表達水平顯著性下調(diào)(P<0.05)；與E組小鼠相比，TE組小鼠海馬的ADAM10的蛋白表達水平下調(diào)，但兩組之間不具有顯著性差異，而APP蛋白、Aβ42蛋白水平則極顯著性上調(diào)(P<0.01)；與C組小鼠相比，E組小鼠海馬的ADAM10蛋白水平雖上調(diào)，但兩組并無顯著差異，APP和Aβ42蛋白表達水平均有下調(diào)趨勢，但兩組之間亦無顯著性差異(表3，圖3)。

表3 各組小鼠海馬ADAM10、APP和Aβ42相對于GAPDH的蛋白表達水平一覽表Table 3 Protein Expression of ADAM10,APP and Aβ42 to GAPDH in the Hippocampus of Four Groups

圖3 各組小鼠海馬ADAM10、APP和Aβ42相對于GAPDH的蛋白表達水平示意圖Figure 3. Protein Expression of ADAM10,APP and Aβ42 to GAPDH in the Hippocampus of four Groups

3 討論

本研究證實，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬內(nèi)APP和Aβ42的表達水平較野生型小鼠均顯著增加，而抑制APP水解產(chǎn)生Aβ的α-分泌酶的表達水平顯著降低，說明該轉(zhuǎn)基因小鼠海馬內(nèi)α-分泌酶在APP非淀粉樣蛋白水解途徑中的作用可能被抑制，APP水解傾向于淀粉樣蛋白產(chǎn)生途徑，導致Aβ沉積的增加。而經(jīng)過16周的自主跑輪運動，轉(zhuǎn)基因運動組小鼠較轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M小鼠，其海馬內(nèi)APP和Aβ42的表達水平均得到顯著性下調(diào)，且α-分泌酶3種亞型中的2種(ADAM10和ADAM17)得到顯著性上調(diào)。因此，自主跑輪運動可能通過上調(diào)α-分泌酶的表達進而促進APP的非淀粉蛋白水解途徑，抑制APP的淀粉樣蛋白水解途徑，減少了海馬Aβ的沉積。

3.1 自主跑輪運動對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬APP蛋白表達的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M小鼠海馬APP的蛋白表達水平顯著性高于野生型對照組小鼠，說明本研究所采用的轉(zhuǎn)基因小鼠能夠成功的模擬AD病理特征，即AD腦內(nèi)APP基因的過表達特性。兩組轉(zhuǎn)基因小鼠相比較，則發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因運動組小鼠海馬APP蛋白表達水平被顯著性下調(diào)，說明本研究中所采用的16周的自主跑輪運動能夠有效地調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)過表達的APP水平。而通過對轉(zhuǎn)基因運動組小鼠和野生型運動組小鼠的對比發(fā)現(xiàn)，兩組小鼠在APP的蛋白表達水平上仍然存在極顯著性的差異，說明16周的自主跑輪運動未能逆轉(zhuǎn)APP基因的過表達狀態(tài)，但在兩個轉(zhuǎn)基因組小鼠間，運動可下調(diào)轉(zhuǎn)基因小鼠海馬APP蛋白表達水平，說明運動干預可能在一定范圍內(nèi)抵御由于APP基因過表達而導致的APP的蛋白水平的上調(diào)。對兩個野生型組小鼠的比較發(fā)現(xiàn)，運動組小鼠海馬APP的蛋白水平較對照組低，但二者之間不具有顯著性差異，說明野生型小鼠海馬APP的基礎蛋白表達水平較低，可經(jīng)過正常的非淀粉樣蛋白途徑降解而使其維持在較低的水平，而自主跑輪運動對野生型小鼠海馬正常水平APP表達的調(diào)節(jié)不如對轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)過度表達的APP蛋白調(diào)節(jié)的敏感性高。

有研究發(fā)現(xiàn)，當腦內(nèi)APP基因過度表達而超出其正常降解水平時，傾向于產(chǎn)生更多的Aβ沉積，同時可導致APP通過多個途徑產(chǎn)生Aβ[10]。體外實驗發(fā)現(xiàn)，APP的過表達可導致神經(jīng)元的病變，如致使神經(jīng)細胞的死亡，同時體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，實驗動物腦認知功能的損害以及腦內(nèi)出現(xiàn)大量淀粉樣斑塊物質(zhì)的沉積[29]。還有研究發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)APP的過度表達可能是其經(jīng)異常途徑水解和Aβ沉積產(chǎn)生，進而導致AD發(fā)病的重要因素[15]。

本研究所采用的實驗動物是過度表達APP基因的小鼠，檢測結(jié)果充分證實其腦內(nèi)APP基因被過度表達。而本實驗通過16周的自主跑輪運動干預能夠有效地抑制其腦內(nèi)的APP蛋白表達水平，比前也有類似的報道，如Wolf等[36]采用APP-23轉(zhuǎn)基因AD小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，與對照組小鼠相比，將該轉(zhuǎn)基因小鼠置于帶有跑輪的豐富環(huán)境干預實驗中能夠顯著性降低其腦內(nèi)APP的基因表達水平。徐波等[4]采用D-半乳糖造模AD大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，8周的跑臺運動能夠顯著抑制模型組大鼠海馬APP的基因表達水平。Liu等[25]研究發(fā)現(xiàn)，5月的長期跑臺運動雖然未能顯著性降低APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬的APP蛋白表達水平，但運動卻顯著性抑制了APP的淀粉樣途徑的水解產(chǎn)物CTFs和sAPPβ的蛋白水平。以上研究均說明，運動能夠抑制AD實驗動物腦內(nèi)的APP表達或其水解產(chǎn)物的表達水平。

3.2 自主跑輪運動對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬ADAMs的影響

α-分泌酶是APP非淀粉樣蛋白水解途徑的重要水解酶，而APP的非淀粉樣蛋白水解是腦內(nèi)APP正常水解的主要途徑。若α-分泌酶活動異常，腦內(nèi)APP將不能正常水解，并可能激活其他的異常水解途徑(如β-分泌酶發(fā)揮作用)導致Aβ產(chǎn)生。α-分泌酶的3個重要成員ADAM9、ADAM10和ADAM17在APP正常水解中發(fā)揮著不可或缺的作用，三者中，ADAM10可直接發(fā)揮著在APP的α-分泌酶位點降解APP的作用[22]，而ADAM9[21]和ADAM17[31]在α-分泌酶對APP水解的過程中也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，與野生型對照組小鼠相比，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬ADAM10 mRNA表達水平和蛋白表達水平均顯著性下調(diào)，說明APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬內(nèi)ADAM10表達的減少是APP在腦內(nèi)過度累積的重要原因之一。對轉(zhuǎn)基因運動組小鼠和轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M小鼠比較發(fā)現(xiàn)，運動組小鼠海馬ADAM10 mRNA表達水平和蛋白水平均顯著性上調(diào)，結(jié)合上文所述的自主運動下調(diào)了轉(zhuǎn)基因小鼠海馬APP的蛋白表達，說明自主運動可通過促進轉(zhuǎn)基因小鼠海馬ADAM10的表達進而促進APP向非淀粉樣蛋白途徑水解，促進了APP的正常代謝，減少其過度積累。對兩個野生型組小鼠比較發(fā)現(xiàn)，與對照組小鼠相比，運動組小鼠海馬ADAM10 mRNA和蛋白水平均有上調(diào)趨勢，但均不具有顯著性差異，其原因一方面可能與自主跑輪運動的強度有關(guān)，可以從野生型小鼠和轉(zhuǎn)基因組小鼠在跑輪距離(圖1)的差異上進行解釋，總體上看，野生型小鼠的運動量顯著小于轉(zhuǎn)基因組小鼠；另一方面，ADAM10的表達水平可能與野生型小鼠腦內(nèi)APP生成與水解的動態(tài)平衡有關(guān)，低水平的APP可能通過反饋性機制調(diào)節(jié)ADAM10的表達量。運動促進ADAM10的表達也得到了其他研究的證實，Liu等[25]研究發(fā)現(xiàn)，5個月的長期跑臺運動能夠有效上調(diào)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬的ADAM10蛋白表達水平。孔繁軍等[2]研究發(fā)現(xiàn)，6個月的跑臺運動顯著增強了APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦ADAM10的活性水平。

本研究發(fā)現(xiàn)，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬ADAM9 和ADAM17 mRNA表達水平與野生型小鼠相比均無顯著性差異；APP/PS1轉(zhuǎn)基因運動組小鼠海馬ADAM9和ADAM17 mRNA表達水平較APP/PS1轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M小鼠均上調(diào)，但ADAM9 mRNA表達水平在兩組間不具有顯著性差異，而運動卻顯著上調(diào)了轉(zhuǎn)基因小鼠海馬ADAM17 mRNA的表達；兩組野生型小鼠的比較發(fā)現(xiàn)，運動組小鼠海馬ADAM9和ADAM17 mRNA表達水平較對照組小鼠均上調(diào)，但在ADAM9 mRNA表達上兩組之間無顯著性差異，而運動組小鼠的ADAM17 mRNA的表達水平極顯著上調(diào)。這提示，自主運動對ADAM17的調(diào)節(jié)程度比對ADAM9的調(diào)節(jié)更顯著，也暗示ADAM17在調(diào)節(jié)APP的非淀粉樣蛋白水解途徑中具有更顯著的效果。本實驗室的前期研究[37]發(fā)現(xiàn)，8周的有氧跑臺運動能夠在促進D-半乳糖造模AD大鼠海馬ADAM17 mRNA表達水平顯著上調(diào)的同時抑制海馬Aβ42水平。由于本研究僅檢測了各組小鼠海馬ADAM9和ADAM17 mRNA表達情況，未進一步檢測二者的蛋白表達情況，自主運動對二者mRNA表達水平的調(diào)節(jié)，可能只在一定程度上說明運動具有促進ADAM9和ADAM17在腦內(nèi)表達的效果，不能完全成為證實運動干預對二者水平調(diào)節(jié)的確切依據(jù)，還需進一步深入研究。

3.3 自主跑輪運動對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬Aβ42的影響

Aβ42是最重要的APP降解產(chǎn)物，它比其他的Aβ產(chǎn)物更加難溶，且較易聚積，一旦在神經(jīng)細胞外沉積形成斑塊，便難以清除，是神經(jīng)細胞外老年斑的最主要成分，具有較強的神經(jīng)毒性，可誘導神經(jīng)細胞的功能紊亂，損害腦的認知功能，導致AD的神經(jīng)病理學特征。

本研究采用的APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠是研究Aβ沉積誘發(fā)AD的最佳實驗動物之一，有研究發(fā)現(xiàn)，該轉(zhuǎn)基因小鼠在4月齡[27]或6月齡[30]時即可在海馬內(nèi)檢測到Aβ沉積。而本研究運動干預時間在小鼠3～7月齡期間，因此，可驗證16周運動對該轉(zhuǎn)基因小鼠海馬Aβ沉積的影響。本實驗發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，轉(zhuǎn)基因小鼠海馬Aβ42蛋白表達顯著增加，說明兩種小鼠在Aβ42表達水平上存在先天性差異，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠已在分子水平上表現(xiàn)出AD病理特征。同時，本實驗結(jié)果也可在一定程度上驗證前人發(fā)現(xiàn)的該轉(zhuǎn)基因小鼠在6月齡即出現(xiàn)海馬Aβ沉積的結(jié)論。

對兩組轉(zhuǎn)基因小鼠比較發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因運動組小鼠海馬Aβ42蛋白表達水平較轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M小鼠顯著下調(diào)，提示，16周自主跑輪運動可有效促使轉(zhuǎn)基因小鼠海馬的Aβ蛋白水平的減少。此前研究發(fā)現(xiàn)，自主跑輪運動能夠有效下調(diào)AD動物腦內(nèi)的Aβ水平，如Adlard等[5]對TgCRND8轉(zhuǎn)基因小鼠的研究，Nichol等[26]對Tg2576轉(zhuǎn)基因小鼠的研究，Mesa等[12,13]對3xTg-AD三轉(zhuǎn)基因小鼠的研究均證實，自主跑輪運動可促進轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ水平的下調(diào)。

對轉(zhuǎn)基因運動組小鼠和野生型運動組小鼠的對比發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠海馬Aβ42蛋白表達水平存在極顯著性差異?；谙惹暗难芯炕A，Aβ42是AD腦內(nèi)淀粉樣蛋白沉積的主要組成部分，其在轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的基礎水平可能較高，而運動干預能夠在一定范圍內(nèi)抑制Aβ42的表達水平，但由于Aβ42難溶且易于聚積而沉積形成斑塊的特性在一定程度上可能會抵消運動干預對其抑制性作用。提示，16周的跑輪運動能夠在一定程度上下調(diào)轉(zhuǎn)基因小鼠海馬Aβ42的蛋白表達水平，但運動干預并不能使其水平降低至野生型小鼠的水平。

對兩個野生型組小鼠的比較發(fā)現(xiàn)，Aβ42蛋白表達水平無顯著性差異，提示，野生型小鼠腦內(nèi)Aβ代謝處于產(chǎn)生和清除的動態(tài)平衡狀態(tài)，腦內(nèi)Aβ的基礎水平較低，而運動干預對正常水平Aβ的調(diào)節(jié)作用較弱，說明運動對腦內(nèi)正常水平的Aβ不具有明顯的調(diào)節(jié)作用；也說明，野生型小鼠腦內(nèi)APP可能主要是在α-分泌酶的作用下經(jīng)非淀粉樣蛋白途徑水解，α-分泌酶競爭性抑制了β-分泌酶的功能，致使腦內(nèi)Aβ蛋白處于較低的水平。

有不少研究發(fā)現(xiàn)，跑臺運動也能夠下調(diào)AD實驗動物腦內(nèi)的Aβ水平，如Cho等[8]對NSE/PS2m轉(zhuǎn)基因AD小鼠的研究，Um等[33]對NSE/APPswe轉(zhuǎn)基因小鼠的研究，Um等[34]對NSE/PS2m轉(zhuǎn)基因AD小鼠的研究，Kang等[18]對PS2轉(zhuǎn)基因小鼠的研究等均證實跑臺運動可抑制轉(zhuǎn)基因AD小鼠腦內(nèi)Aβ水平。本實驗室前期研究[37]也發(fā)現(xiàn)，8周的跑臺運動抑制了D-半乳糖造模AD大鼠海馬Aβ42的表達。綜合本研究結(jié)果與先前研究結(jié)論可以發(fā)現(xiàn)，無論是自主跑輪運動還是跑臺運動均能不同程度的抑制AD腦內(nèi)的Aβ水平。

4 結(jié)論

APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬APP和Aβ42的蛋白表達水平較同月齡野生型小鼠顯著性增加，其海馬的α-分泌酶的mRNA和蛋白表達水平顯著降低。16周的自主跑輪運動能夠顯著性下調(diào)轉(zhuǎn)基因小鼠海馬APP和Aβ42的蛋白表達水平，上調(diào)α-分泌酶主要家族成員的mRNA和蛋白表達水平。推測自主跑輪運動可能通過提高轉(zhuǎn)基因小鼠海馬α-分泌酶的表達，進而下調(diào)海馬APP的表達，抑制海馬Aβ的沉積。

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Research on Effect of α-secretase on Regulating Hippocampal APP and Aβ42 in APP/PS1 Transgenic Mice of Alzheimer’s disease after Voluntary Wheel Running

YU Feng1,XU Bo2,JI Liu2

Objective:To observe the effect of α-secretase on the hippocampal APP cleaving and Aβ42 deposition in transgenic mice of Alzheimer’s disease (AD) after 16 weeks voluntary wheel running.Methods:24 male APP/PS1 transgenic mice of line C57 that expresses human mutant APP and PS1 in the brain were chosen and divided into wheel running group (TE,n=12) and control group (TC，n=12).Meanwhile,24 male wild-type mice in line C57 were chose and divided into wheel running group (E,n=12) and control group (C，n=12).Mice in group TE and group E were subjected to wheel running with ad libitum access to food and water for 16 weeks from 3 months of age.Mice in group TC and group C were subjected to food and water ad libitum,without exercise.Real-time RT-PCR was used to detect mRNA level of the main member of α-secretase,ADAM9,ADAM10 and ADAM17.Western blot was used to detect protein level of APP,ADAM10 and Aβ42.Results:(1)16 weeks wheel running significantly up-regulated the expression of ADAM10 mRNA (P<0.01) and ADAM10 protein (P<0.05) in the hippocampus of APP/PS1 transgenic mice.(2)16 weeks wheel running significantly up-regulated the expression of ADAM17 mRNA (P<0.05) in the hippocampus of APP/PS1 transgenic mice.(3) 16 weeks wheel running significantly decreased the protein expression of APP (P<0.05) and Aβ42 (P<0.05) in the hippocampus of APP/PS1 transgenic mice.Conclusion:16 weeks wheel running decreased the level of APP and its production Aβ42 by promoting the gene expression of α-secretase in the hippocampus of APP/PS1 transgenic mice.

voluntarywheelrunning;Alzheimer’sdisease;APP/PS1transgenicmice;hippocampus;α-secretase;APP;Aβ42

2015-10-21；

2016-06-05

青少年P(guān)OWER工程協(xié)同創(chuàng)新中心項目(44801400/011);國家自然科學基金項目(31371204)。

余鋒(1983-)，男，河南信陽人，講師，博士，主要研究方向為腦健康的運動干預，Tel：(0517)83525585，E-mail：yfyf005@163.com；徐波(1963-)，男，山東萊陽人，教授，博士，博士研究生導師，主要研究方向為體育運動與身心健康、運動營養(yǎng)學，Tel：(021)54342612，E-mail:bxu@tyxx.ecnu.edu.cn；季瀏(1961-)，男，江蘇泰興人，教授，博士，博士研究生導師，主要研究方向為青少年體質(zhì)健康評價、體育課程與教學、體育心理學，Tel：(021)54345131，E-mail:lji@tyxx.ecnu.edu.cn。

1.淮陰師范學院，江蘇 淮安 223300;2.華東師范大學 “青少年健康評價與運動干預”教育部重點實驗室，上海 200241 1.Huaiyin Normal University,Huaian,223300,China;2.East China Normal University,Shanghai 200241,China.

G804.2

A

10.16469/j.css.201607006