郭 文，羅學港，王 慧，陳 旦

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降鈣素基因相關肽對大鼠運動性疲勞的影響

郭 文1，羅學港2，王 慧2，陳 旦2

目的：探討降鈣素基因相關肽(CGRP)對大鼠運動性疲勞的影響。方法：成年健康雄性SD大鼠，依據不同的預處理措施隨機分成5組：空白對照組、磷酸鹽緩沖液(PBS)預處理組、CGRP預處理組、辣椒素(CAP)預處理組、CAP預處理+ CGRP預處理組，各組動物在安靜狀態(tài)時、運動80 min時和運動至力竭后即刻處死。然后用免疫組化和放射免疫方法檢測上述條件下大鼠腓腸肌神經肌肉接頭CGRP的表達變化；用蘇木精-伊紅(HE) 染色觀察上述條件下運動性疲勞大鼠骨骼肌形態(tài)結構的變化；用化學比色的方法檢測上述條件下骨骼肌超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、過氧化氫酶(CAT)及丙二醛(MDA)的變化。結果：1)給予CGRP預處理后，大鼠運動至力竭的時間明顯縮短(P<0.05)，而給予CAP預處理后大鼠運動至力竭的時間明顯延長(P<0.05)；2)CGRP免疫組織化學和放射免疫結果顯示，CGRP的免疫陽性產物在肌纖維縱切面上，其形狀為橢圓形或棒狀，主要分布于肌纖維膜的表面。給予CGRP預處理后，大鼠腓腸肌神經肌肉接頭CGRP的表達明顯升高(P<0.05)，而給予CAP預處理后，大鼠腓腸肌神經肌肉接頭CGRP的表達明顯下降(P<0.05)；3)HE染色顯示，安靜狀態(tài)下各組骨骼肌的形態(tài)結構未見明顯改變；與安靜狀態(tài)相比，運動80min時除CGRP預處理組骨骼肌的細胞核明顯增多、增大外，其余各組均無明顯改變；力竭運動后即刻與安靜狀態(tài)下相比，除CAP預處理組無明顯改變外，其余各組骨骼肌的細胞核均明顯增多、增大；4)化學比色結果顯示，給予CGRP預處理后，大鼠骨骼肌中SOD、GSH-PX 和CAT的活性明顯下降(P<0.05)，MDA的含量明顯上升(P<0.05)，而給予CAP預處理后大鼠骨骼肌中SOD、GSH-PX 和CAT的活性明顯上升(P<0.05)，MDA的含量明顯下降(P<0.05)。結論：CGRP 加劇了運動性疲勞的產生。

降鈣素基因相關肽；運動性疲勞；骨骼肌；自由基

運動性疲勞是機體對運動訓練刺激所產生的一系列綜合性復雜反應，易導致骨骼肌系統(tǒng)損傷，神經內分泌系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等功能障礙，機體的運動能力下降[7,19,28,32]。運動性疲勞的產生不僅與中樞神經系統(tǒng)沒有足夠的運動神經元驅動有關，而且與神經肌肉接頭傳遞的失敗及周圍肌肉代謝水平的改變有關。因此，神經肌肉接頭是運動性疲勞在外周產生的一個重要位點。目前，有關運動性疲勞與神經肌肉接頭的研究主要集中于突觸前和突觸后[27,31]。在突觸前其可能存在的機制有：Ca2+內流的下降；Ca2+對神經末梢囊泡釋放敏感性的下降；可利用的囊泡數量下降。在突觸后其可能存在的機制有：乙酰膽堿受體(AChR)的脫敏；肌纖維膜興奮性的下降。

自從在腦、脊髓運動神經元和運動神經末梢檢測出降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)后，CGRP在神經肌肉接頭作為一種神經調質和/或營養(yǎng)補劑就被廣泛研究[5,10,20,25]。CGRP被輸送到神經肌肉接頭的神經末梢后貯存在致密核心小泡(LDCV)[6,15]，以Ca2+依賴方式伴隨神經刺激而釋放[10,22,30]，從而影響肌肉的代謝、結構和功能特征。因此，CGRP的變化將導致該神經所支配骨骼肌的代謝、結構和功能特征的改變[24]。研究表明，CGRP有“雙重效應”，正常生理條件下CGRP的釋放對靶組織起營養(yǎng)作用，能夠擴張周圍血管，促進AChR的合成，并對睪丸下降、胃腸活動、胃酸分泌等有良好的功效，并能抑制活性氧自由基的產生和緩減組織的氧化應激，對組織起內源性的保護作用，然而，在應激或病理條件下，CGRP也能直接或間接的導致脊髓、骨骼肌興奮性的改變和炎癥的發(fā)生，對組織造成損傷[12,17]。有關CGRP與運動性疲勞的關系，Homonko等和Theriault(1997)等的研究表明，一次性大強度的運動可導致大鼠后肢運動神經元CGRP顯著提高[13]；另有研究表明，在運動過程中骨骼肌CGRP的改變與運動和/或骨骼肌的缺血缺氧有關[4]，這提示，CGRP可能與運動性疲勞的產生有關，但CGRP在運動性疲勞大鼠神經肌肉接頭的生理和生物學角色目前仍不清楚。

本研究通過一次性運動至力竭疲勞動物模型，運用免疫組化、放射免疫、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE) 染色和化學比色的方法并結合補充外源性的CGRP和皮下注射CGRP耗竭劑的方法檢測CGRP對大鼠運動至力竭時間、骨骼肌的形態(tài)結構、酶的活性和自由基代謝的影響，探索CGRP與運動性疲勞之間的潛在關系。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與主要試劑

成年健康雄性SD大鼠150只，體重200～250 g，購自湖南農業(yè)大學動物科學學院，所有動物經一般體查均無異常。所有大鼠都置于同一動物房，分籠飼養(yǎng)，室溫16～22℃，相對濕度45%～55%，正常晝夜節(jié)律，自由飲食。CGRP、辣椒素和多克隆兔抗CGRP抗體均購于Sigma公司，骨骼肌超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)、過氧化氫酶(catalase,CAT)及丙二醛(malondialdehyde,MDA)均購于南京建成生物工程研究所，CGRP 放射免疫試劑盒購于北京東亞放免技術研究所。

1.2 動物模型制備

1.3 實驗動物分組

將150只大鼠依據不同的預處理措施隨機分成5組：空白對照組、PBS預處理組、CGRP預處理組、CAP預處理組、CAP預處理+CGRP預處理組，各組大鼠在安靜狀態(tài)時、運動80 min時和運動至力竭后即刻處死。

1.4 PBS、CGRP和CAP的預處理

大鼠皮下注射PBS、CAP、純化的大鼠CGRP。PBS預處理組、CGRP預處理組和CAP預處理組于力竭運動前4天兩次皮下給予PBS(每次300 μl)、CGRP(每次120 μg，300 μl PBS溶解，Sigma)和CAP (每次50 mg/kg，溶于10%無水酒精+10%吐溫-80+80%生理鹽水中)。CAP預處理+ CGRP預處理組于力竭運動前8天的前1～4天兩次皮下給予CAP (每次50 mg/kg，溶于10%無水酒精+10%吐溫-80+80%生理鹽水中)，后5～8天兩次皮下給予CGRP(每次120 μg，300 μl PBS溶解，Sigma)。

1.5 組織制備

各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛(4 ml/kg)，待麻醉后快速取左側腓腸肌內側頭，除去表面的凝血及結締組織，經冰冷生理鹽水洗滌幾次，用濾紙吸干水分，用做放射免疫分析的標本放入1 ml 0.1 M冰醋酸在手動勻漿管中冰浴勻漿研磨，用做酶活性和自由基檢測的標本按1 g組織中加入10 mL冰鹽水的比例作為勻漿介質在手動勻漿管中稀釋，并勻漿研磨，再經4℃ 3 000 r/min離心10 min，取上清液貯存于-20℃冰箱保存待測。

用作免疫組織化學染色和HE染色的組織，在上述大鼠麻醉快速取下左側腓腸肌內側頭后，開胸經左心室插管入升主動脈，先灌以生理鹽水(150 ml)，繼之以4%多聚甲醛磷酸緩沖液(500 ml，pH7.4，4℃)灌注固定，先快后慢。取右側腓腸肌內側頭，剔除筋膜，入相同的灌注液4℃后固定過夜，0.01 M PBS充分洗滌后，OCT包埋于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 CGRP免疫組織化學染色

標本于-80℃冰箱取出后，-20℃三頓恒低溫切片機切片，片厚200 μm，進行CGRP免疫組織化學染色，采用漂浮法，主要過程如下：1)切片用0.01 M PBS(pH 7.4)振動漂洗3次，每次10 min；2)入含0.3%的甲醇雙氧水，20 min；3)0.01 M PBS(pH 7.4)振動漂洗3次，每次10 min；4)入5 %正常小牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉2 h；5)入1∶1 000的多克隆兔抗CGRP抗體(Sigma)4℃孵育過3夜；6)0.01 M PBS(pH 7.4)振動漂洗3次，每次10 min；7)入1∶200生物素化山羊抗兔IgG(Vector)37℃孵育2 h；8)0.01 M PBS(pH 7.4)振動漂洗3次，每次10 min；9)入1∶200 ABC 復合物(Vector，預先 30 min配制)，37℃ 2 h；10)入0.05% DAB + 0.03%雙氧水顯色,0.01 M PBS終止反應、貼片、常規(guī)脫水、透明、封片。

陰性對照采用正常小牛血清代替一抗，其余步驟與上述相同，結果為陰性。

1.7 骨骼肌CGRP濃度的測定

測定時用0.1 M的PBS 5倍稀釋。按要求依次加樣后，充分混勻，室溫放置20 min后，4℃ 3 000 rpm離心25 min，取上清液，在γ計數器上測定CPM數。通過預先編制的程序，直接給出CGRP濃度。

1.8 HE染色

標本于-80℃冰箱取出后，0.01 M PBS充分洗滌后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片厚4 μm。HE染色按下列步驟進行：常規(guī)脫蠟，梯度乙醇脫水后行HE染色。蘇木精液染色6 min，流水沖洗，1%鹽酸處理3 s，稍水洗，1%氨水返藍5 s，流水沖洗，0.5%伊紅液染色3 min，稍水洗，80%、90%、100%乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.9 SOD、GSH-PX、CAT活性測定及MDA含量測定

SOD、GSH-PX、CAT的活性及MDA的含量測定采用比色法，組織蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍法。具體操作如下：1)取樣品加入潔凈試管中，依次加入各試劑，混勻，95℃或37℃水浴，加入中止液；2)蒸餾水調零，測定吸光度OD值；3)空白管用蒸餾水代替樣品，標準管用標準液代替樣品，其他步驟相同；4)根據樣品、空白管、標準管在分光光度計上的吸光度值，按公式計算MDA的含量和SOD、GSH-PX、CAT的活性。

1.10 數據收集處理

切片在Motic顯微鏡下觀察，CGRP的免疫組織化學染色和HE染色于每組每只動物各取3張切片，每張切片采用Nikon Coolpix 950數碼相機在Motic顯微鏡下隨機取8個部位攝片。

2 實驗結果

2.1 平均力竭時間

各組大鼠平均運動至力竭的時間如表1所示：空白對照組和PBS預處理組相比，兩組大鼠平均運動至力竭的時間無顯著性差異；CAP預處理組大鼠運動至力竭的時間明顯延長，與空白對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CGRP預處理組大鼠運動至力竭的時間明顯縮短，與空白對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；CAP預處理+CGRP預處理組與空白對照組相比，大鼠運動至力竭的時間有所下降，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 本研究大鼠運動至力竭的時間一覽表Table 1 The Time of the Rat Treadmill

2.2 不同干預措施條件下運動性疲勞大鼠腓腸肌神經肌肉接頭CGRP的表達變化

CGRP的免疫陽性產物在肌纖維縱切面上，其形狀為橢圓形或棒狀，主要分布于肌纖維膜的表面。

1.在安靜狀態(tài)下。空白對照組(圖1A)、PBS預處理組(圖1B)和CAP預處理+CGRP預處理組(圖1E)的免疫陽性產物表達較少，呈色較淺；CGRP預處理組(圖1C)的免疫陽性產物較空白對照組明顯增多，反應增強，呈色較深；而CAP預處理組大鼠(圖1D)的免疫陽性產物較空白對照組有所減少，呈色變淺。

圖1 運動性疲勞大鼠腓腸肌CGRP免疫組織化學圖Figure1.CGRP Immunohistochemistry of Gastrocnemius Muscle after Exercise-induced Fatigue(Bar=50 μm)

放射免疫結果顯示(表2)，空白對照組、PBS預處理組和CAP預處理+CGRP預處理組相比，大鼠神經肌肉接頭CGRP的表達量無明顯差別(P>0.05)；但CGRP預處理組與空白對照組相比，大鼠神經肌肉接頭CGRP的表達量明顯升高(P<0.05)，而CAP預處理組大鼠與空白對照組相比，大鼠神經肌肉接頭CGRP的表達量明顯下降(P<0.05)。

表2 運動性疲勞大鼠腓腸肌CGRP 濃度一覽表Table 2 The CGRP Concentration of Gastrocnemius Muscle after Exercise-induced Fatigue(pg/mg wet weight)

2.運動80 min時。與安靜狀態(tài)時相比，除CGRP預處理組免疫陽性產物明顯增多，反應增強，呈色較深外，其余各組的免疫陽性產物均有所下降，反應減弱，呈色變淺(圖1)；CGRP預處理組(圖1H)的免疫陽性產物較空白對照組增多，反應增強，呈色較深； 而CAP預處理組大鼠(圖1I)的免疫陽性產物較空白對照組有所減少，呈色變淺。

放射免疫結果顯示(表2)，與安靜狀態(tài)時相比，各組運動80 min時，大鼠神經肌肉接頭CGRP的表達量除CGRP預處理組顯著上升外(P<0.05)，其余各組CGRP的表達量均有所下降(P<0.05)；CGRP預處理組與空白對照組相比，大鼠神經肌肉接頭CGRP的表達量明顯升高(P<0.05)，而CAP預處理組大鼠與空白對照組相比，大鼠神經肌肉接頭CGRP的表達量明顯下降。

3.力竭運動后即刻。各組的免疫陽性產物與安靜狀態(tài)下各對應組相比明顯增多，反應增強，呈色變深(圖1)；CGRP預處理組(圖1M)的免疫陽性產物較空白對照組明顯增多，反應增強，呈色變深； 而CAP預處理組大鼠(圖1N)的免疫陽性產物較空白對照組有所減少，呈色變淺。

放射免疫結果顯示(表2)，與安靜狀態(tài)時相比，各組力竭運動后即刻大鼠神經肌肉接頭CGRP的表達量顯著上升(P<0.05)；CGRP預處理組與空白對照組相比，大鼠神經肌肉接頭CGRP的表達量明顯升高(P<0.05)，而CAP預處理組大鼠與空白對照組相比，大鼠神經肌肉接頭CGRP的表達量明顯下降(P<0.05)。

2.3 HE染色

HE染色結果顯示(圖2)，安靜狀態(tài)下各組骨骼肌的形態(tài)結構未見明顯改變；運動80 min時與安靜狀態(tài)下相比，除CGRP預處理組骨骼肌的細胞核明顯增多、增大外，其余各組均無明顯改變；力竭運動后即刻與安靜狀態(tài)下相比除CAP預處理組無明顯改變外，其余各組骨骼肌的細胞核均明顯增多、增大。2.4 骨骼肌MDA含量及SOD、GSH-PX、CAT活性的檢測

表3表明，在安靜狀態(tài)時，各組之間MDA含量的變化差異無顯著性(P>0.05)。運動80 min時，空白對照組、PBS預處理組和CAP預處理+CGRP預處理組相比，MDA的含量也無明顯差別；但CGRP預處理組與空白對照組相比，MDA的含量顯著上升(P<0.05)；而CAP預處理組與空白對照組相比，MDA的含量略有上升，但差異無顯著性(P>0.05)。力竭運動后即刻，空白對照組、PBS預處理組和CAP預處理+CGRP預處理組相比，MDA的含量也無明顯差別；但CGRP預處理組與空白對照組相比，MDA的含量顯著上升(P<0.05)；CAP預處理組與空白對照組相比，MDA的含量也有所上升，但差異無顯著性(P>0.05)。運動80 min時、力竭運動后即刻各組與安靜狀態(tài)下各對應組相比較，MDA的含量均顯著上升(P<0.05)。

表4、表5、表6表明，在安靜狀態(tài)時，各組之間SOD、GSH-PX和CAT的活性變化差異無顯著性(P>0.05)。運動80 min時，空白對照組、PBS預處理組和CAP預處理+CGRP預處理組相比，SOD、GSH-PX和CAT的活性差異也無顯著性(P>0.05)；但CGRP預處理組與空白對照組相比，SOD、GSH-PX和CAT的活性顯著下降；而CAP預處理組大鼠與空白對照組相比，SOD、GSH-PX和CAT的活性顯著上升(P<0.05)。力竭運動后即刻，空白對照組、PBS預處理組和CAP預處理+CGRP預處理組相比，SOD、GSH-PX和CAT的活性也無明顯差別；但CGRP預處理組與空白對照組相比，SOD、GSH-PX和CAT的活性顯著下降(P<0.05)；而CAP預處理組大鼠與空白對照組相比，SOD、GSH-PX和CAT的活性顯著上升(P<0.05)。運動80 min時、力竭運動后即刻各組與安靜狀態(tài)下各對應組相比較，骨骼肌SOD和GSH-PX的活性均顯著上升(P<0.05)；CAT的活性在運動80 min時、力竭運動后即刻各組與安靜狀態(tài)下各對應組相比較，除CGRP預處理組差異無顯著性外，其余各組均顯著上升(P<0.05)。

3 討論

本研究運用一次性運動至力竭疲勞動物模型，通過給大鼠皮下注射CGRP和用CAP耗竭CGRP的方法從行為學、形態(tài)學和生理機能的角度檢測CGRP對大鼠運動性疲勞的影響，探索CGRP與運動性疲勞之間的潛在關系。

本研究首先測量了不同干預措施條件下大鼠運動至力竭的平均時間。研究結果表明，給大鼠皮下注射CGRP后，在其他組運動至80 min時該組已達力竭狀態(tài)，大鼠運動至力竭的時間縮短大約37%；而用CAP耗竭內源性CGRP后大鼠運動至力竭的時間延長大約32%。這提示，CGRP可能加速了大鼠運動性疲勞的產生。

圖2 運動性疲勞大鼠腓腸肌HE染色圖Figure 2. HE Stain of Gastrocnemius Muscle after Exercise-induced Fatigue(Bar=50 μm)

表3 運動性疲勞大鼠腓腸肌MDA 含量一覽表Table 3 The MDA Content of Gastrocnemius Muscle after Exercise-induced Fatigue(nmol/mg prot)

表4 運動性疲勞大鼠腓腸肌SOD 活性一覽表Table 4 The SOD Activity of Gastrocnemius Muscle after Exercise-induced Fatigue(U/mg)

表5 運動性疲勞大鼠腓腸肌GSH-PX的活性一覽表Table 5 The GSH-PX Activity of Gastrocnemius Muscle after Exercise-induced Fatigue(U/mg)

表6 運動性疲勞大鼠腓腸肌CAT的活性一覽表Table 6 The CAT Activity of Gastrocnemius Muscle after Exercise-induced Fatigue(U/mg)

通過免疫組織化學和放射免疫的方法，測試不同干預措施條件下大鼠安靜狀態(tài)、運動至80 min時、力竭運動后即刻腓腸肌神經肌肉接頭CGRP的變化，發(fā)現力竭運動后即刻，大鼠腓腸肌神經肌肉接頭CGRP的表達量與安靜狀態(tài)時相比明顯上升。以往研究表明，一次大強度的下坡跑后，大鼠后肢運動神經元的CGRP顯著提高，并持續(xù)2周左右，到第四周恢復到安靜水平[13]，這與本研究結果基本一致。運動神經元CGRP表達的增加可能是由于運動時腓腸肌的收縮提高了相關運動神經元的發(fā)放活動，從而引起運動神經元CGRP的表達均增加。運動80 min時各組與安靜狀態(tài)下各對應組相比較，除CGRP預處理組外，其余各組CGRP的表達量有所下降，這可能是由于大鼠經過一段時間的運動，機體機能狀態(tài)未達到力竭水平出現的一種保護性現象。給大鼠皮下注射CGRP后，無論安靜狀態(tài)、運動80 min時，還是力竭運動后即刻，大鼠腓腸肌神經肌肉接頭CGRP的表達均明顯升高，而補充CAP后，無論安靜狀態(tài)、運動80 min時，還是力竭運動后即刻大鼠腓腸肌神經肌肉接頭CGRP的表達均明顯下降。這說明，本研究的干預是有效的。

為了進一步了解CGRP對運動性疲勞的影響，本研究檢測了不同干預措施條件下CGRP對大鼠骨骼肌形態(tài)結構及骨骼肌酶的活性和自由基含量的影響。1990年，Fisher等通過建立大鼠鈍挫傷模型，發(fā)現傷后骨骼肌出現了許多肌細胞核，形態(tài)類似衛(wèi)星細胞，說明，骨骼肌細胞核的變化可初步反映骨骼肌受損傷的程度。本研究發(fā)現，給大鼠皮下注射CGRP，運動至80 min時(力竭運動后即刻)大鼠骨骼肌的細胞核明顯增多、增大，而用CAP耗竭CGRP后大鼠骨骼肌細胞核增多、增大的現象不明顯。提示，CGRP干預導致了顯著的肌細胞形態(tài)學改變，因而，CGRP可能加速了骨骼肌的損傷。骨骼肌細胞核的增多、增大可能與以下原因有關：1)骨骼肌損傷時，肌衛(wèi)星細胞分裂，變成紡錘形的成肌細胞，然后多個成肌細胞融合成管狀的多核細胞(稱為肌管)，最后變成骨骼肌纖維；2)破碎骨骼肌纖維的細胞核及其周圍的肌漿可變?yōu)槌杉〖毎?)結締組織中的某種細胞也可分化為成肌細胞[1]。

研究表明，通過測量大鼠骨骼肌中MDA的含量及SOD、GSH-PX 和CAT的活性能反映大鼠的運動能力及運動性疲勞的產生[8,9,33]。MDA是細胞脂質過氧化的一種主要產物，生物膜脂質的不飽和脂肪酸最易受到自由基的攻擊而發(fā)生過氧化，所以，組織MDA的含量可反映機體脂質過氧化水平，間接反映機體細胞受自由基攻擊損傷的嚴重程度[16,18]。在自由基的連鎖反應中，SOD、GSH-PX 和CAT都是機體內的抗過氧化物酶。SOD是體內主要的自由基清除酶，能夠催化超氧陰離子歧化為O2和H2O2，從而保護細胞膜和線粒體等免受氧化損傷，而H2O2可以被GSH-PX 和CAT催化分解為O2和H2O[2,14]。CAT 主要集中在過氧化物酶體中，而GSH-PX 主要在細胞質中。GSH-PX能特異地催化GSH對H2O2的還原反應，起到保護細胞膜結構和功能完整性的作用[23]。本研究表明，給大鼠皮下注射CGRP后，與空白對照組相比，大鼠骨骼肌中MDA含量顯著升高，SOD、GSH-PX 和CAT的活性顯著下降，而用CAP耗竭CGRP后，與空白對照組相比，大鼠骨骼肌中MDA含量顯著下降，SOD、GSH-PX 和CAT的活性顯著升高。這提示，CGRP在一定程度上增加了大鼠力竭運動后體內自由基的生成量，降低了體內自由基的清除，增加了自由基對細胞脂質成分的氧化損傷作用，加速了運動性疲勞的產生。研究報道，CGRP有預防小鼠自身免疫性糖尿病發(fā)病及抗氧化應激的作用，增加SOD和CAT的生成，降低MDA的含量[26]。這一報道與本研究結果正好相反，這可能與實驗模型或CGRP劑量有關。在脊椎動物骨骼肌，CGRP通過作用于CGRP受體，誘發(fā)肌肉的收縮[29]，在成年嚙齒類動物膈肌，CGRP縮短了肌肉收縮的相對不應期[11]，上調了骨骼肌纖維cAMP的水平[21]。結合本研究實驗結果，認為，CGRP對大鼠運動性疲勞的影響可能是由于CGRP對骨骼肌長時間的作用導致骨骼肌長時間收縮，從而引起大鼠運動性疲勞的提前發(fā)生。

綜上所述，本研究觀察到CGRP干預可導致大鼠運動至力竭的時間縮短，形態(tài)學上骨骼肌損傷加劇，骨骼肌自由基生成增多，提示，CGRP加速了運動性疲勞的產生。但是，CGRP加速運動性疲勞產生的具體機制，尤其是其下游的作用靶點，需要更進一步的研究。

4 結論

CGRP干預后，大鼠運動至力竭的時間明顯下降，骨骼肌的細胞核明顯增多、增大，MDA的含量上升，SOD、GSH-PX和CAT的活性下降，提示，CGRP可能介導了運動性疲勞的產生。

[1]戚正本.多核細胞的形成機理及其運動醫(yī)學意義[J].體育成人教育學刊,2007,23(6):49-51.

[2]BAYRAKTAR N,KILIC S,BAYRAKTAR M R,etal.Lipid peroxidation and antioxidant enzyme activities in cancerous bladder tissue and their relation with bacterial infection:A controlled clinical study[J].J Clin Lab Anal,2010,24(1):25-30.

[3]BEDFORD T G,TIPTON C M,WILSON N C,etal.Maximum oxygen consumption of rats and its changes with various experimental procedures[J].J Appl Physiol,1979,47(6):1278-1283.

[4]BELL D,MCDERMOTT B J.Calcitonin gene-related peptide in the cardio-vascular system:Characterization of receptor populations and their (patho) physiological significance[J].Pharmacol Rev,1996,48(2):253-288.

[5]BLESCH A,TUSZYNSKI M H.GDNF gene delivery to injured adult CNS motor neurons promotes axonal growth,expression of the trophic neuropeptide CGRP,and cellular protection[J].J Comp Neurol,2001,436(4):399-410.

[7]CARMICHAEL M D,DAVIS J M,MURPHY E A,etal.Role of brain macrophages on IL-1beta and fatigue following eccentric exercise-induced muscle damage[J].Brain Behav Immun,2010,24(4):564-568.

[8]CHI A,LI H,KANG C,etal.Anti-fatigue activity of a novel polysaccharide conjugates from Ziyang green tea[J].Int J Biol Macromol,2015,80:566-572.

[9]FAN W,WU X,PAN Y,etal.1-(1,3-Benzodioxol-5-yl-carbo-nyl) piperidine,a modulator of α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid receptor,ameliorates exercise-induced fatigue in mice[J].Biol Pharm Bull,2014,37(1):13-17.

[10]FERNANDEZ H L,ROSS G S,NADELHAFT I.Neurogenic calcitonin gene-related peptide:A neurotrophic factor in the maintenance of acetylcholinesterase molecular forms in adult skeletal muscles[J].Brain Res,1999,844(1-2):83-97.

[11]FLEMING N W,LEWIS B K,WHITE D A,etal.Acute effects of calcitonin gene-related peptide on the mechanical and electrical responses of the rat hemidiaphragm[J].J Pharmacol Exp Ther,1993,265(3):1199-1204.

[12]GARDINER S M,COMPTON A M,KEMP P A,etal.Haemodynamic effects of human a-calcitonin gene-related peptide following administration of endothelin-1 or N-nitro-Larginine methyl ester in conscious rats[J].Br J Pharmacol,1991,103(1):1256-1262.

[13]HOMONKO D A,THERIAULT E.Calcitonin gene-related pe-ptide is increased in hindlimb motoneurons after exercise[J].Int J Sports Med,1997,18:1-7.

[14]KIM K C,KANG K A,ZHANG R,etal.Risk reduction of ethyl acetate fraction of Empetrum nigrum var.Japonicum via antioxidant properties against hydrogen peroxide-induced cell damage[J].J Toxicol Environ Health A,2009,72(21-22):1499-1508.

[15]KLOOT W V D,BENJAMIN W B,BALEZINA O P.Calcitonin gene-related peptide acts presynaptically to increase quantal size and output at frog neuromuscular junctions[J].J Physiol,1998,507(Pt3):689-695.

[16]LIANG Y,FANG J Q,WANG C X,etal.Effects of transcutaneous electric acupoint stimulation on plasma SOD and MDA in rats with sports fatigue[J].Acupuncture Res,2008,33(2):120-123.

[17]LU J T,SON Y J,LEE J,etal.Mice lacking alpha-calcitonin gene-related peptide exhibit normal cardiovascular regulation and neuromuscular development[J].Mol Cell Neurosci,1999,14(2):99-120.

[19]MAGAL M,DUMKE C L,URBIZTONDO Z G,etal.Relationship between serum creatine kinase activity following exercise-induced muscle damage and muscle fibre composition[J].J Sports Sci,2010,13:1-10.

[21]MATSUMOTO N,UCHIDA S,WANG X B,etal.Effect of denervation of the phrenic nerve on the action of calcitonin gene-related peptide in rat diaphragm[J].Life Sci,1990,47(6):547-555.

[22]NAVES L A,KLOOT W V D.Repetitive nerve stimulation decreases the acetylcholine content of quanta at the frog neuromuscular junction[J].J Physiol,2001,532(Pt3):637-647.

[23]NAZIROGLU M,CIHANGIR UGUZ A,KO?AK A,etal.Acetaminophen at different doses protects brain microsomal Ca2+-ATPase and the antioxidant redox system in rats[J].J Membr Biol,2009,231(2-3):57-64.

[24]RINGER C,WEIHE E,SCHüTZ B.Pre-symptomatic alterations in subcellular betaCGRP distribution in motor neurons precede astrogliosis in ALS mice[J].Neurobiol Dis,2009,35(2):286-295.

[25]ROSA E,CHA J,BAIN J R,etal.Calcitonin gene-related peptide regulation of glial cell-line derived neurotrophic factor in differentiated rat myotubes[J].J Neurosci Res,2015,93(3):514-520.

[26]SHE F,SUN W,MAO J M,etal.Calcitonin gene-related peptide gene therapy suppresses reactive osygen species in the pancreas and prevents mice from autoimmune diabetes[J].Acta Physiologica Sinica,2003,55(6):625-632.

[27]SIECK G C,PRAKASH Y S.Fatigue at the neuromuscular junction.Branch point vs.presynaptic vs.postsynaptic mechanisms[J].Adv Exp Med Biol,1995,384:83-100.

[28]THOMSON R L,ROGERS D K,HOWE P R,etal.Effect of acute exercise-induced fatigue on maximal rate of heart rate increase during submaximal cycling[J].Res Sports Med,2015,20:1-15.

[29]TORGAN C E,KRAUS W E.Regulation of type II adenylyl cyclase mRNA in rabbit skeletal muscle by chronic motor nerve pacing[J].Am J Physiol,1996,271(2 Pt 1):E253-260.

[30]UCHIDA S,YAMAMOTO H,IIO S,etal.Release of calcitonin gene-related peptide-like immunoreactive substance from neuromuscular junction by nerve excitation and its action on striated muscle[J].J.Neurochem,1990,54(3):1000-1003.

[31]URBANO F J,LINO N G,GONZLEZ-INCHAUSPE C M,etal.Acid-sensing ion channels 1a (ASIC1a) inhibit neuromuscular transmission in female mice[J].Am J Physiol Cell Physiol,2014,306(4):C396-406.

[32]WEBER T,DUCOS M,MULDER E,etal.The relationship between exercise-induced muscle fatigue,arterial blood flow and muscle perfusion after 56 days local muscle unloading[J].Clin Physiol Funct Imaging,2014,34(3):218-29.

[33]YANG Q,JIN W,LV X,etal.Effects of macamides on endurance capacity and anti-fatigue property in prolonged swimming mice[J].Pharm Biol,2015,9:1-8.

Effects of Calcitonin Gene-related Peptide on the Exercise-induced Fatigue of Rats

GUO Wen1,LUO Xue-gang2,WANG Hui2,CHEN Dan2

The purpose of this paper is to study the effects of CGRP on the exercise-induced fatigue of rats.Methods:Healthy adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into five groups according to the different pretreatment:the blank control group,the PBS pretreatment group,the CGRP pretreatment group,the CAP pretreatment group,the CAP pretreatment +CGRP pretreatment group.The rats were sacrificed at the resting state,the exercise to 80 min and the exercise to exhaustion,Then the immunohistochemistry and radioimmunoassay was used to detecting the expression of CGRP at the condition of the different pretreatment,the HE staining was used to detecting the change of morphous formation of skeletal muscle at the condition of the different pretreatment,the chemistry colorimetric method was used to detecting the change of superoxide dismutase,glutathione peroxidase,catalase,and malondialdehyde at the conditions of the different pretreatment.Results:1) The time of the treadmill exercise to exhaustion was significantly decurtated after CGRP pretreatment (P<0.05),and the time of the treadmill exercise to exhaustion was significantly prolonged after CAP pretreatment (P<0.05).2) Immunohistochemistry and radioimmunoassay showed that CGRP immunopositive products were elliptical or rod-shape at longitudinal section of muscle fiber.The expression of CGRP was significantly increased after the CGRP pretreatment (P<0.05),and the expression of CGRP was significantly decreased after the CAP pretreatment (P<0.05).3) HE staining showed that there were no obvious differences in amorphous constitution of skeletal muscle in all groups at the resting state.There were also no obvious changes in morphous constitution of skeletal muscle at the other groups at the exercise to 80 min than at the resting state,excluding cell nucleus of skeletal muscle were significantly increased and augmented at the CGRP pretreatment group,Cell nucleus of skeletal muscle were significantly increased and augmented in all other groups,while there were no obvious changes in morphous constitution of skeletal muscle at the CAP pretreatment group at exercise to exhaustion than at the resting state.4) The chemistry colorimetric showed that the content of MDA was significantly increased (P<0.05),and the activity of SOD,GSH-PX,CAT was significantly decreased after the CGRP pretreatment (P<0.05),While the content of MDA was significantly decreased (P<0.05),and the activity of SOD,GSH-PX,CAT was significantly increased after the CAP pretreatment (P<0.05).Conclusions:The CGRP intensified the generation of exercise-induced fatigue.

calcitoningene-relatedpeptide;exercise-inducedfatigue;skeletalmuscles;freeradical

2015-12-08；

2016-06-23

湖南省教育科學規(guī)劃基金項目(XJK011QTM002)。

郭文(1978-)，女，湖南益陽人，副教授，博士，主要研究方向為運動與神經系統(tǒng)的損傷修復，E-mail：gw7808200@163.com。

1.湖南師范大學 體育學院，湖南 長沙 410012；2.中南大學 湘雅醫(yī)學院，湖南 長沙 410013 1.Hunan Normal University,Changsha 410012,China;2.Central South University,Changsha 410013,China.

G804.7

A

10.16469/j.css.201607008