吳傳松，李耀華

（國家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心，北京，100044）

HBV基因分型檢測試劑性能評估研究要點(diǎn)

吳傳松，李耀華

（國家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心，北京，100044）

依據(jù)《體外診斷試劑注冊管理辦法》和乙型肝炎病毒核酸分型試劑自身特點(diǎn)，提出對 HBV基因分型檢測試劑性能研究的特殊要求。對該類試劑的參考品和質(zhì)控品研制、陽性／陰性參考品符合率、最低檢測限、分析特異性、精密度、基因混合型研究、攜帶污染率等方面進(jìn)行了詳細(xì)解析。闡述了乙型肝炎病毒基因分型類體外診斷試劑的性能研究要點(diǎn)。為從事該類產(chǎn)品注冊申報(bào)前性能研究的行業(yè)人員提供參考。

HBV基因型； 性能研究

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）基因型分型檢測試劑是指利用包括分子生物學(xué)相關(guān)方法在內(nèi)的核酸檢測技術(shù)，以 HBV基因序列為檢測靶標(biāo)，對人血清、血漿等樣本中的HBV不同基因型進(jìn)行體外定性檢測的試劑。結(jié)合臨床表現(xiàn)和其他實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，乙型肝炎病毒基因型分型可作為乙型肝炎感染者臨床診療的輔助指標(biāo)之一。由于不同的乙型肝炎病毒基因型對現(xiàn)有藥物治療可能存在不同的治療響應(yīng)，乙型肝炎病毒分型基因檢測在慢性乙型肝炎患者治療中的作用正被越來越多人所關(guān)注［1］。檢測試劑的性能優(yōu)劣直接影響檢測結(jié)果是否能夠有效反映臨床樣本的真實(shí)狀態(tài)，檢測試劑性能也是反映產(chǎn)品主要原材料選擇、生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系等多方面因素是否合理的客觀評價(jià)指標(biāo)。檢測試劑性能研究應(yīng)作為研究者在研制產(chǎn)品時(shí)的重點(diǎn)關(guān)注環(huán)節(jié)，并應(yīng)在產(chǎn)品生產(chǎn)和使用過程中不斷研究并改進(jìn)，以期在臨床應(yīng)用時(shí)，減少產(chǎn)品檢測過程中可能出現(xiàn)的假陰性和假陽性［2］，避免因檢測結(jié)果錯(cuò)誤造成患者延誤治療或治療方案制定不當(dāng)。檢測試劑性能的研究方案應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品的反應(yīng)原理、臨床用途、使用條件等綜合因素進(jìn)行設(shè)計(jì)。產(chǎn)品性能評估應(yīng)涵蓋研制階段對試劑盒進(jìn)行的所有性能驗(yàn)證的研究資料，包括具體研究方法、內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析等詳細(xì)資料［3］。本文主要針對目前用核酸擴(kuò)增反應(yīng)原理的乙型肝炎基因型分型試劑盒在申請上市前進(jìn)行性能研究的過程中，應(yīng)注意的常見問題進(jìn)行闡述。

1 產(chǎn)品分析性能

1.1 最低檢測限

對不同 HBV基因型進(jìn)行系列稀釋，通過對不同系列稀釋樣本檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后，選取95%（n≥20）檢出率水平作為最低檢出限確定標(biāo)準(zhǔn)。申報(bào)試劑時(shí)，對說明書描述的所有基因型應(yīng)在病毒濃度最低檢出限或接近最低檢出限的條件下進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2 分析特異性

1.2.1 交叉反應(yīng) 用于 HBV基因分型檢測試劑交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病原體種類，主要考慮與 HBV基因分型核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的臨床癥狀的病原體，以及不同基因型之間、乙型肝炎病毒其他基因型對被檢測基因型的影響。對于難以獲得的基因型，可采用針對該基因型構(gòu)建的相同靶基因序列質(zhì)粒進(jìn)行交叉驗(yàn)證。建議用高濃度的病原體對乙型肝炎病毒核酸陰性樣本進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗(yàn)證。研究者還應(yīng)將所有用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病毒和細(xì)菌的來源、種屬／型別和濃度確認(rèn)方法等因素納入分析特異性研究方案。

1.2.2 干擾物質(zhì) 影響該類檢測試劑的潛在干擾物質(zhì)主要包括內(nèi)源性干擾物質(zhì)和外源性干擾物質(zhì)。內(nèi)源性干擾物質(zhì)是指樣本中常見的影響檢測結(jié)果的物質(zhì)，如血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素等；外源性干擾物質(zhì)是指影響檢測結(jié)果的常用抗凝劑、常用抗病毒藥物、干擾素、保肝治療藥物，如拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋、替比夫定等。在評價(jià)干擾物質(zhì)對該類試劑性能影響時(shí)，建議在病毒的檢測臨界值水平對每種干擾物質(zhì)的干擾影響進(jìn)行檢測。干擾物濃度的范圍應(yīng)覆蓋人體生理及病理狀態(tài)下可能出現(xiàn)的物質(zhì)濃度。應(yīng)注明不同干擾物質(zhì)對被檢測物質(zhì)無干擾的最高限值。對于不易收集的干擾物質(zhì)樣本，可使用臨床模擬樣本進(jìn)行調(diào)節(jié)［4］。

1.3 精密度

精密度具體實(shí)驗(yàn)方法可以參考相關(guān)國外或國內(nèi)有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評估文件進(jìn)行。研究者應(yīng)對每項(xiàng)精密度指標(biāo)的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)的范圍等。針對本類產(chǎn)品的精密度評價(jià)，用于評價(jià)的樣本濃度至少應(yīng)包含陰性、弱陽性和強(qiáng)陽性三個(gè)水平。同時(shí)，應(yīng)設(shè)置合理的精密度評價(jià)周期方案。申請人還應(yīng)選擇不同環(huán)境的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以對室間精密度進(jìn)行評價(jià)。

1.4 陽性／陰性參考品符合率

所有基因型別的陽性參考品均應(yīng)按要求檢出陽性。考慮到濃度梯度的不同，應(yīng)對各水平陽性參考品設(shè)置相應(yīng)PCR循環(huán)閾值（Ct值）的限制；陰性參考品在各個(gè)引物探針組合的檢測條件下其結(jié)果均應(yīng)為陰性。

2 企業(yè)內(nèi)部校準(zhǔn)品及質(zhì)控品的建立

2.1 內(nèi)部參考品及試劑內(nèi)對照（質(zhì)控品）

由于乙型肝炎病毒不易培養(yǎng)，制備相應(yīng)的參考品及質(zhì)控品時(shí)，建議采用滅活病毒的血清／血漿。參考品及質(zhì)控品的檢測方法應(yīng)與被測臨床樣本的檢測方法一致。同時(shí)，在不同級參考品及質(zhì)控品體系建立過程中，應(yīng)具備完成的溯源鏈體系。

企業(yè)內(nèi)部參考品以及質(zhì)控品的設(shè)置必須客觀合理，能夠充分評價(jià)產(chǎn)品的質(zhì)量。應(yīng)采用核酸測序方法或其他方法對企業(yè)內(nèi)部參考品以及質(zhì)控品中的物質(zhì)成分進(jìn)行確認(rèn)。

2.2 陽性參考品及陽性質(zhì)控品

陽性參考品應(yīng)包含試劑盒所能檢測的所有基因型（所有的單基因型以及所有的重組基因型），每個(gè)基因型應(yīng)設(shè)置不同濃度水平。為滿足驗(yàn)證產(chǎn)品性能的需要，至少應(yīng)設(shè)置兩個(gè)濃度水平（弱陽性、中或強(qiáng)陽性）。常見基因型（如B型、C型）陽性參考品設(shè)置建議采用滅活病毒的血清／血漿；其他基因型陽性參考品設(shè)置可采用模擬臨床樣本。對于陽性參考品的獲取方式，建議使用核酸測序方法或者其他能證明問題的方法進(jìn)行確認(rèn)。

陽性質(zhì)控品應(yīng)包含目標(biāo)靶基因，用于監(jiān)控整個(gè)檢測過程。陽性質(zhì)控品作為單獨(dú)檢測過程，目的是模擬患者樣本，用于與患者樣本進(jìn)行同時(shí)檢測。

2.3 陰性參考品及陰性質(zhì)控品

可采用經(jīng)確認(rèn)無目標(biāo)靶基因序列的樣本。陰性參考品及陰性質(zhì)控品用于反映非特異擴(kuò)增或檢測過程，當(dāng)不存在目標(biāo)序列時(shí)不應(yīng)有相關(guān)信號。陰性參考品設(shè)置建議采用滅活的血清／血漿。陰性質(zhì)控品應(yīng)參與樣本核酸的平行提取，對假陽性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制。

2.4 靈敏度參考品（檢測限參考品）

靈敏度參考品是評價(jià)產(chǎn)品檢測能力的重要工具，對于定性產(chǎn)品來說，其設(shè)計(jì)的合理性顯得非常重要。在基因型設(shè)置方面，應(yīng)包括試劑盒所包含的所有基因型；在濃度設(shè)置方面，應(yīng)采用核酸定量的方法對該參考品進(jìn)行定量檢測，明確被測物的具體量值，設(shè)置濃度應(yīng)接近產(chǎn)品最低檢出限。

2.5 精密度參考品

精密度參考品應(yīng)反映產(chǎn)品檢測的重復(fù)性以及重復(fù)檢測的穩(wěn)定性。該部分參考品應(yīng)采用臨床樣本作為精密度參考品，需包括陰性、弱陽性、中或強(qiáng)陽性三個(gè)濃度水平的精密度驗(yàn)證。

2.6 內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）

與目標(biāo)靶基因平行提取、擴(kuò)增，用于對檢測管內(nèi)抑制物造成的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制。內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）可采用競爭性或非競爭性的引物設(shè)置［5］。

2.7 其他需要注意問題

如單個(gè)產(chǎn)品的檢驗(yàn)原理為兩種方法學(xué)或多種方法學(xué)聯(lián)合檢測，應(yīng)對產(chǎn)品中每種方法學(xué)均設(shè)置參考品及質(zhì)控品，用于對不同種方法學(xué)的質(zhì)量監(jiān)控，例如：檢測原理為 PCR-雜交方法聯(lián)用，在這種情況下，不僅需在PCR環(huán)節(jié)設(shè)置參考品及質(zhì)控品對擴(kuò)增過程進(jìn)行質(zhì)量控制，同時(shí)在基因探針雜交環(huán)節(jié)也必須設(shè)置質(zhì)控程序?qū)﹄s交過程進(jìn)行質(zhì)量控制。

3 其他

3.1 基因混合型的研究

該部分研究主要包括兩個(gè)目的：第一是研究申報(bào)試劑檢測不同濃度混合型的能力，申請人應(yīng)設(shè)置不同濃度比例的混合型進(jìn)行驗(yàn)證；第二是研究申報(bào)試劑在判讀結(jié)果時(shí)，是否能夠有效的區(qū)分基因重組型和基因混合型，申請人應(yīng)設(shè)置不同濃度的基因重組型與不同混合比例的基因混合型進(jìn)行驗(yàn)證。

因理想的不同濃度比例基因混合型樣本在臨床單位中難以收集，申報(bào)人可以使用臨床模擬樣本進(jìn)行驗(yàn)證。建議該部分樣本用核酸測序明確樣本中包含的所有基因型序列，同時(shí)應(yīng)使用核酸定量的方法確定不同基因型的濃度。如申報(bào)產(chǎn)品的結(jié)果判讀無法有效區(qū)分基因混合型與基因重組型，應(yīng)在產(chǎn)品說明書中進(jìn)行注明。

3.2 HBV核酸分離純化

病毒DNA提取的主要目的是富集目的基因濃度、保證目的基因序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除 PCR抑制物，這是決定PCR成敗的重要因素之一。研究者都應(yīng)對核酸提取的環(huán)節(jié)做詳細(xì)的驗(yàn)證。

3.3 交叉污染和攜帶污染研究

該類產(chǎn)品是用于檢測乙型肝炎病毒感染人群。在臨床檢測中發(fā)現(xiàn)，部分臨床樣本會(huì)出現(xiàn)高濃度的乙型肝炎病毒載量。這部分臨床樣本在提取過程中會(huì)增加交叉污染及攜帶污染的可能性。在核酸提取過程中，陰性樣本可能因?yàn)楸粡?qiáng)陽性樣本污染，導(dǎo)致最終檢測結(jié)果為假陽性。

如采用自動(dòng)提取設(shè)備提取 DNA，在攜帶污染試驗(yàn)中，建議將高濃度陽性樣本與陰性樣本在同一待提取反應(yīng)板中連續(xù)交替排列，并應(yīng)進(jìn)行多輪上述提取研究。建議試驗(yàn)使用的高陽性樣本水平調(diào)整在接近該產(chǎn)品檢測能力的上限，將鄰近高陽性樣本的陰性樣本的檢測結(jié)果與未鄰近高陽性樣本的陰性樣本的檢測結(jié)果比較，以評估攜帶和交叉污染對檢測結(jié)果造成的影響。

［1］劉錫光，白東亭，賈繼東.乙型肝炎和丙型肝炎實(shí)驗(yàn)診斷與致癌機(jī)制.北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：170-190.

［2］徐偉文.體外診斷試劑研制常用技術(shù)指標(biāo)之分析性能評估.分子診斷與治療雜志，2010，3（2）：140-144.

［3］呂允鳳.乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑性能評價(jià)要點(diǎn).中國藥事，2013.9（10）：1072-1074.

［4］FDA.Nucleic Acid Based In Vitro Diagnostic Devices for Detection of Microbial Pathogens［EB／OL］.（2005-12-08）［2012-08-10］http：／／www.fda.gov／cdrh／oivd／guidance／1560.html

［5］李金明.實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù).北京：人民軍醫(yī)出版社，2007：190-199.

（張?jiān)鑫渚庉嫞?/p>

Registration Performance Evaluation Requirement for the Hepatitis B Virus Genotyping Detection Reagent

WU Chuan-song，LI Yao-hua
（Center for Medical Devices Evaluation of CFDA，Beijing 100044，China）

In accordance with IVD Registration Regulation and the Hepatitis B Virus Genotyping Detection Reagent’s own characteristics，the special requirements for the product performance evaluation were analyzed.Detailed analysis such reagents reference materials and quality control materials，positive／negative reference product compliance rate，the lowest sensitivity，analytical specificity，precision，hybrid genetic research and carry-over study were carried out.The main points of product performance of the hepatitis B virus genotype detection reagents were discussed.The results provided the reference information for the relevant personnel conducting performance evaluation study before submitting the registration application.

Hepatitis B Virus Genotype； Performance evaluation

10.11748／bjmy.issn.1006－1703.2016.01.033

2015-03-03；

2015-05-18

吳傳松，男，碩士，助理研究員，從事醫(yī)療器械技術(shù)審評。