韋傳寶，鄧 輝

(1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012；2.抗體制備及其質(zhì)量檢測(cè)中心，安徽 六安 237012)

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與尖吻蝮蛇出血毒素高親和力動(dòng)物血管壁蛋白的提取與檢測(cè)

韋傳寶1，2，鄧 輝1

(1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012；2.抗體制備及其質(zhì)量檢測(cè)中心，安徽 六安 237012)

為了測(cè)定動(dòng)物血管壁上是否含有對(duì)尖吻蝮蛇出血毒素有高親和力的靶蛋白，從4種蛋白質(zhì)提取試劑盒種篩選1種試劑盒，提取11種動(dòng)物的血管壁蛋白質(zhì)，用血管壁蛋白質(zhì)作為抗原，采用ELISA檢測(cè)方法測(cè)定提取的血管壁蛋白質(zhì)是否含有與尖吻蝮蛇出血毒素有高親和力的靶蛋白。結(jié)果表明：三種酸性出血毒素(AaH Ⅰ、AaH Ⅱ和AaH Ⅳ)對(duì)11種動(dòng)物血管壁提取蛋白的檢測(cè)結(jié)果為陽性，堿性出血毒素(AaH Ⅲ)對(duì)11種動(dòng)物血管壁提取蛋白的檢測(cè)結(jié)果基本上為陰性。因此，動(dòng)物體內(nèi)，特別是作為尖吻蝮蛇食物來源的動(dòng)物體內(nèi)血管壁上可能含有與尖吻蝮蛇出血毒素有高親和力的靶蛋白。

尖吻蝮蛇；出血毒素；靶蛋白；ELISA檢測(cè)

尖吻蝮蛇(Agkistrodonacutus) 俗稱五步蛇, 屬蝰科、蝮亞科、蝮屬，分布于我國長(zhǎng)江以南地區(qū)(包括臺(tái)灣)，是我國特有蛇種，劇毒。該蛇為血循環(huán)型毒蛇, 咬傷后傷口和內(nèi)臟大量出血，致死、致殘率極高。

前人從不同產(chǎn)地的尖吻蝮蛇毒中分離出多種出血毒素。徐詢等[1]最先從皖南產(chǎn)尖吻蝮蛇毒中分離出3種低分子量出血毒素，分別命名為出血毒素Ⅰ(AaH Ⅰ)、出血毒素 Ⅱ(AaH Ⅱ)和出血毒素 Ⅲ(AaH Ⅲ)；隨后朱中良等[2]從皖南產(chǎn)尖吻蝮蛇毒中純化出1種中等分子量的出血毒素，命名為出血毒素Ⅳ(AaH Ⅳ)。

對(duì)尖吻蝮蛇出血毒素分離和性質(zhì)方面的研究較為深入，但對(duì)出血機(jī)制的研究很少，一直未有實(shí)質(zhì)性的突破。何華平等[3]用辣根過氧化物酶標(biāo)記AaH Ⅰ并進(jìn)行免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)，觀察到AaH Ⅰ可以特異地結(jié)合到家兔毛細(xì)血管壁上，推測(cè)毛細(xì)血管內(nèi)壁上可能存在AaH Ⅰ的靶蛋白。論文作者韋傳寶等[4]研究125I-AaH Ⅰ和腎毛細(xì)血管組織的結(jié)合特性，發(fā)現(xiàn)125I-AaH I和家兔腎毛細(xì)血管組織的結(jié)合具有時(shí)間飽和性、濃度飽和性，未標(biāo)記AaH I與125I-AaH I有競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合特性，pH低于5.8或高于8.0時(shí)結(jié)合能力下降，這些特性間接證明血管壁可能有AaH I靶蛋白存在。本研究用蛋白質(zhì)提取試劑盒提取血管壁蛋白質(zhì)，用ELISA檢測(cè)方法測(cè)定血管壁上是否含有與尖吻蝮蛇出血毒素有親和力的蛋白質(zhì)-靶蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料

尖吻蝮蛇毒購自安徽省祁門縣祁門蛇傷研究所；羊抗小鼠IgG-堿性磷酸酶購自Sigma公司；四種出血毒素(AaH Ⅰ、AaH Ⅱ、AaH Ⅲ和AaH Ⅳ)、四種出血毒素的抗血清由皖西學(xué)院蛋白質(zhì)與酶工程研究中心提供；蛋白抽提試劑盒(通用型，W001)、膜蛋白抽提試劑盒(增強(qiáng)型，W002)、蛋白抽提試劑盒(CW004)、蛋白抽提試劑盒(CW0891)購自Vazyme公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)、層析柜、酶標(biāo)儀、電泳儀、電泳槽等。

1.2 血管豐富組織的獲得

取小鼠肌肉組織各10 g，加入20 mL生理鹽水，置組織搗碎機(jī)粉碎。取出破碎后的懸浮，在1 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心5分鐘，棄去上清液(破碎的肌肉組織)，沉淀為血管組織豐富的部分，沉淀用生理鹽水洗滌、離心，重復(fù)3次，進(jìn)一步去除破碎組織，將沉淀分裝放入-80 ℃超低溫冰箱中保存，待用。

1.3 蛋白質(zhì)提取試劑盒的篩選

以1.2制備的血管豐富組織為材料，分別用購買的4種蛋白質(zhì)提取試劑盒提取血管壁蛋白質(zhì)，4種試劑盒分別為：蛋白抽提試劑盒(通用型，W001)、膜蛋白抽提試劑盒(增強(qiáng)型，W002)、蛋白抽提試劑盒(CW004)、蛋白抽提試劑盒(CW0891)，血管豐富組織用量為0.1 g,提取的操作按照說明書步驟進(jìn)行。獲得的4種蛋白質(zhì)提取物進(jìn)行ELISA檢測(cè)，確定哪種試劑盒提取的蛋白質(zhì)含靶蛋白。采用ELISA方法檢測(cè)，形成的復(fù)合物為：高親和性蛋白(靶蛋白)-對(duì)應(yīng)的出血毒素-對(duì)應(yīng)出血毒素IgG-二抗(堿性磷酸酶共價(jià)結(jié)合)。

1.4 不同動(dòng)物血管壁蛋白的提取

準(zhǔn)備11種動(dòng)物的肌肉組織，11種動(dòng)物分別為：河蝦、田螺、泥鰍、鯽魚、黃鱔、牛蛙、甲魚、烏龜、鴿子、豬和小白鼠。首先制備11種動(dòng)物的血管豐富組織，然后用“1.3 蛋白質(zhì)提取試劑盒的篩選”篩選的蛋白質(zhì)提取試劑盒提取11種動(dòng)物肌肉血管壁蛋白，血管豐富組織用量為0.1 g,提取的操作按照對(duì)應(yīng)試劑盒的說明書操作步驟進(jìn)行。提取的蛋白質(zhì)冷凍條件下保存待用。

1.5 與尖吻蝮蛇出血毒素高親和力靶蛋白的檢測(cè)

采用常規(guī)的ELISA檢測(cè)[5](P158-183)，大致過程如下：1)用包被液(0.05M碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，pH 9.6)稀釋提取的血管壁蛋白。取0.2 mL 蛋白質(zhì)提取液，加0.8 mL 包被液，稀釋后溶液的pH約9.6。以稀釋后血管壁蛋白作為包被抗原，以包被液代替樣品作為空白對(duì)照。2)加純化的尖吻蝮蛇出血毒素，如果提取的血管壁蛋白中含與出血毒素親和力強(qiáng)的蛋白質(zhì)-靶蛋白，將形成：高親和性蛋白(靶蛋白)-出血毒素復(fù)合物。3)加對(duì)應(yīng)出血毒素的抗血清，將形成復(fù)合物：高親和性蛋白(靶蛋白)-出血毒素—對(duì)應(yīng)出血毒素IgG。4)加堿性磷酸酶共價(jià)結(jié)合的羊抗小鼠IgG(二抗)，將形成復(fù)合物：靶蛋白-出血毒素-對(duì)應(yīng)出血毒素IgG-二抗。5)加堿性磷酸酶底物p-NPP，顯色30分鐘后，在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD405 nm吸光值。樣品孔的OD405 nm值如果大于空白對(duì)照OD405 nm值2.1倍確定為檢測(cè)陽性，否則確定為檢測(cè)陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 合適試劑盒的篩選

四種蛋白質(zhì)提取試劑盒提取的蛋白ELISA檢測(cè)結(jié)果為：蛋白抽提試劑盒(通用型，W001)OD405 nm=0.230；膜蛋白抽提試劑盒(增強(qiáng)型，W002)OD405 nm=1.570；蛋白抽提試劑盒(CW004)OD405 nm=0.433；蛋白抽提試劑盒(CW0891)OD405 nm=0.688；膜蛋白抽提試劑盒(增強(qiáng)型，W002)提取的效果最好，我們選擇該試劑盒作為提取11種動(dòng)物組織血管壁蛋白的試劑盒。

2.2 11種動(dòng)物組織血管壁蛋白的提取

經(jīng)過膜蛋白抽提試劑盒(增強(qiáng)型，W002)的提取獲得了11種動(dòng)物組織的血管壁蛋白提取液，每種動(dòng)物的提取液約0.6 mL。

2.3 ELISA檢測(cè)結(jié)果

11種動(dòng)物血管壁蛋白提取液的ELISA檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1 11種動(dòng)物血管壁蛋白提取液的ELISA檢測(cè)結(jié)果

從表1中可以看出，三種酸性出血毒素(AaH Ⅰ、AaH Ⅱ和AaH Ⅳ)對(duì)11種動(dòng)物血管壁提取蛋白的檢測(cè)結(jié)果均為陽性，堿性出血毒素(AaH Ⅲ)對(duì)11種動(dòng)物血管壁提取蛋白的檢測(cè)結(jié)果基本上為陰性。說明動(dòng)物體內(nèi)，特別是作為尖吻蝮蛇食物來源的動(dòng)物體內(nèi)血管壁上可能含有與出血毒素有高親和力的靶蛋白。

3 討論

對(duì)毒蛇神經(jīng)毒素的受體及其作用機(jī)制研究比較清楚，蛇毒神經(jīng)毒素結(jié)合到哺乳動(dòng)物神經(jīng)突軸(或神經(jīng)-肌肉結(jié)合部)的特異受體上，抑制神經(jīng)沖動(dòng)的傳導(dǎo)。目前，對(duì)出血機(jī)制的研究報(bào)道大多與人體病理有關(guān)[6-8]，對(duì)動(dòng)物出血毒素出血機(jī)制的詳細(xì)研究未見報(bào)道。蛇毒出血毒素通過直接破壞血管壁基底膜而出血，但出血機(jī)制尚處于推測(cè)和假說階段，關(guān)鍵問題是不知道血管壁上是否有出血毒素的靶蛋白，更不知道靶蛋白的性質(zhì)，本研究目的是確認(rèn)動(dòng)物血管壁上是否存在尖吻蝮蛇出血毒素的靶蛋白，由于堿性出血毒素很少見，出血活性也比較低，本研究出現(xiàn)的堿性出血毒素(AaH Ⅲ)對(duì)11種動(dòng)物血管壁提取蛋白的檢測(cè)結(jié)果基本上為陰性的結(jié)果，不能夠代表出血毒素的一般性質(zhì)，因此，本研究結(jié)果與前人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似[3，4]，傾向于推測(cè)動(dòng)物血管壁上有與尖吻蝮蛇出血毒素高親和力的蛋白，或者稱為靶蛋白。這種推測(cè)是否真實(shí)需要進(jìn)行靶蛋白的分離，只有分離出靶蛋白才能夠?qū)⑼茰y(cè)變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)，分離靶蛋白也是我們今后工作的一個(gè)努力方向，只有解決了這個(gè)問題，與出血機(jī)制相關(guān)的其他問題才能獲得解決。

目前治療蛇傷的有效方法是注射抗尖吻蝮蛇毒血清，但抗蛇毒血清中抗出血毒素IgG濃度較低，加上IgG與出血毒素的結(jié)合是可逆的，出血毒素與靶蛋白的結(jié)合可能更緊密，因此治療效果不佳。靶蛋白確定后可以通過研制類似靶蛋白的物質(zhì)代替抗血清治療蛇咬傷，為有效治療尖吻蝮蛇咬傷開辟了新途徑。

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[3]何華平，王玉珍，徐詢.酶標(biāo)法觀察尖吻蝮出血毒素Ⅰ對(duì)毛細(xì)血管的作用[J].動(dòng)物學(xué)研究，1988(9)：99-101.

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Extraction and Test of High Affinity Target Protein to Agkistrodon acutus Hemorrhagin on Animal Vascular Wall

WEI Chuanbao1,2, DENG Hui1

(1.CollegeofBiologicalandPharmaceuticalEngineering,WestAnhuiUniversity,Lu’an37012,China; 2.AntibodyPreparationandPropertyTestResearchCenter,WestAnhuiUniversity,Lu’an37012,China)

Objective: Determine whether there is high affinity target protein toAgkistrodonacutusHemorrhagin on animal vascular wall. Methods: A protein extraction reagent kit was chosen from four kinds of protein extraction reagent kit. The protein of eleven kinds of animal vascular wall was extracted using the kit which had been chosen. The vascular wall protein was used as antigen and the high affinity target protein toAgkistrodonacutushemorrhagin was tested through ELISA test. Results: There is target protein toAgkistrodonacutusHemorrhagin AaH Ⅰ, AaH Ⅱand AaH Ⅳ in all eleven kinds of animal vascular wall protein. There is no target protein toAgkistrodonacutusHemorrhagin AaH Ⅲ in all eleven kinds of animal vascular wall protein. Conclusion: In animal especially for the animal as a food source forAgkistrodonacutus, there is target protein ofAgkistrodonacutushemorrhagin on vascular wall.

Agkistrodonacutus; Hemorrhagin; target protein; ELISA test

2016-08-26

安徽自然科學(xué)基金項(xiàng)目(1408085MC43)；安徽省教育廳自然科學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2015A454，KJ2013A264)。

韋傳寶(1961-)，男，安徽六安人，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向：蛇毒蛋白。

R991

A

1009-9735(2016)05-0001-03