羅奉奉，莫亞玲，劉鑫泰，李雪鳳，覃玥*

（河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西宜州546300）

纖維素酶產(chǎn)生菌YZB46的產(chǎn)酶條件研究

羅奉奉，莫亞玲，劉鑫泰，李雪鳳，覃玥*

（河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西宜州546300）

為提高纖維素酶產(chǎn)生菌YZB46的產(chǎn)酶能力，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)篩選最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成和最佳發(fā)酵條件。結(jié)果表明，菌株YZB46的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基碳源為1.5%麩皮，氮源為0.6%黃豆粉，無機(jī)鹽為0.1%MgSO4和0.4%KH2PO4；最佳發(fā)酵條件為接種量8%，發(fā)酵液初始pH 5.0，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時(shí)間72 h，在此優(yōu)化的發(fā)酵條件下，菌株YZB46的產(chǎn)酶活力達(dá)37.75 U/mL，是優(yōu)化前的2.21倍。

纖維素酶；正交試驗(yàn)；酶活；優(yōu)化

纖維素是自然界中用之不竭的可再生資源，其作為生產(chǎn)第二代生物燃料解決能源和環(huán)境問題備受許多國(guó)家的重視[1-2]。如今，工、農(nóng)、林業(yè)等對(duì)纖維素廢物利用率低，簡(jiǎn)單的處理（如焚燒等）造成資源浪費(fèi)并污染環(huán)境[3]。因此篩選高產(chǎn)纖維素酶菌株是轉(zhuǎn)化利用纖維素資源的關(guān)鍵，目前獲得高產(chǎn)纖維素酶的來源主要是自然選育和誘變選育[4]，現(xiàn)已有從各種自然環(huán)境中篩選得到來自細(xì)菌、真菌、放線菌等微生物產(chǎn)纖維素酶的報(bào)道[5]，放線菌產(chǎn)酶能力較弱，細(xì)菌相對(duì)于真菌，具有產(chǎn)酶周期短、適應(yīng)力強(qiáng)、分子操作方便等優(yōu)勢(shì)[6]，受到越來越多學(xué)者的重視。而纖維素酶活性低較為普遍，其易受培養(yǎng)條件等因素的影響，這為規(guī)模生產(chǎn)的一大瓶頸[7]，因此研究各類影響酶活因素對(duì)提高纖維素酶活有重要意義。

本研究前期從桑園土壤環(huán)境中篩選得到一株產(chǎn)纖維素酶（carboxymethyl cellulase，CMCase）的蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）YZB46，該菌株有良好的遺傳穩(wěn)定性，可發(fā)揮內(nèi)切葡聚糖酶活性，在pH6.0、30℃條件下發(fā)酵48 h后測(cè)得酶活力為17.08 U/mL，擬通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，以提高菌株產(chǎn)酶能力，對(duì)纖維素酶的進(jìn)一步研究應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）YZB46：本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。

羧甲基纖維素鈉（carboxymethyl cellulose-Na，CMC-Na）、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酒石酸鉀鈉（分析純）：西隴化工股份有限公司；麩皮、黃豆粉：市售，粉碎過60目篩備用；桑枝、稻草秸稈：采集自宜州桑園及郊區(qū)，粉碎過60目篩備用。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g，酵母膏5.0 g，（NH4）2SO42.0 g，KH2PO42.0 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，CaCl2·2H2O 0.4 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.0。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：CMC-Na 10.0 g，蛋白胨5.0 g，（NH4）2SO42.0 g，KH2PO42.0 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.0。

1.2 儀器與設(shè)備

Multiskan MK3酶標(biāo)儀：美國(guó)Bio-Rad公司；Avanti J-E高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Beckman Coulter公司；AE240S型電子分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；HH-S4恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；PHS-3C pH計(jì)：上海智光儀器儀表有限公司；HYG-型培養(yǎng)搖床：上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液的制備

取5%新鮮種子液接種于100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液于4℃、8 000 r/min離心15 min，收集上清液即為粗酶液。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

（1）碳源篩選：分別選取1.0%CMC-Na、麩皮、桑枝粉、稻草粉、葡萄糖、蔗糖、淀粉加入液體發(fā)酵培養(yǎng)基替代碳源，30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h，測(cè)定CMCase酶活力，每組試驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)。

（2）麩皮添加量對(duì)產(chǎn)酶影響：分別以0.5%～2.5%的麩皮作為碳源發(fā)酵，30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h，測(cè)定CMCase酶活力，每組試驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)。

（3）氮源篩選：分別選取0.5%蛋白胨、酵母膏、黃豆粉、（NH4）2SO4、NH4NO3、尿素加入液體發(fā)酵培養(yǎng)基替代氮源，30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h，測(cè)定CMCase酶活力，每組試驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)。

（4）黃豆粉的添加量對(duì)產(chǎn)酶影響：分別以0.2%～1.0%的黃豆粉作氮源發(fā)酵，30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h，測(cè)定CMCase酶活力，每組試驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)。

（5）MgSO4·7H2O濃度對(duì)產(chǎn)酶影響：在培養(yǎng)基中分別添加0.05%～0.30%的MgSO4·7H2O發(fā)酵產(chǎn)酶，30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48h，測(cè)定CMCase酶活力，每組試驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)。

（6）KH2PO4濃度對(duì)產(chǎn)酶影響：在培養(yǎng)基中分別添加0.2%～1.0%的KH2PO4發(fā)酵產(chǎn)酶，30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h，測(cè)定CMCase酶活力，每組試驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)。

（7）正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基組分：在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，取麩皮、黃豆粉、MgSO4含量、KH2PO4含量設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)，確定最優(yōu)產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 培養(yǎng)基組分優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for medium formula optimization

1.3.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)基組分優(yōu)化后，在最適的培養(yǎng)基組合條件下進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶條件研究，以5%的接種量在初始pH 6.0、30℃條件下發(fā)酵48 h為基礎(chǔ)條件進(jìn)行產(chǎn)酶條件單因素試驗(yàn)，設(shè)置不同的初始pH（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）、發(fā)酵溫度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃）、發(fā)酵時(shí)間（24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h）、接種量（2%、5%、8%、11%、14%、17%）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，測(cè)定CMCase酶活力，每組試驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)以初始pH、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、接種量為評(píng)價(jià)因素的4因素3水平正交試驗(yàn)，確定最優(yōu)發(fā)酵條件。正交試驗(yàn)因素與水平見表2。

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Design of orthogonal tests for fermentation conditions optimization

1.3.4 纖維素酶活力（CMCase）測(cè)定

采用DNS法測(cè)定酶反應(yīng)體系產(chǎn)生的葡萄糖[4]。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：取1 mg/mL的葡萄糖溶液2 mL，加1.5 mL DNS試劑，5 min沸水浴后，迅速冷卻至室溫，用去離子水定容至20 mL，在波長(zhǎng)540 nm處測(cè)吸光度值，以葡萄糖含量（mg）和吸光度值（OD540nm值）作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

CMCase測(cè)定：取粗酶液0.5 mL，加入經(jīng)40℃預(yù)熱的含1.5 mL 0.5%CMC-Na的檸檬酸緩沖液（pH5.0，0.05 mol/L）中，混勻，40℃水浴30 min后，立即加1.5 mL DNS試劑，5 min沸水浴后，迅速冷卻至室溫，用去離子水定容至20 mL，以滅活的粗酶液為對(duì)照組，在波長(zhǎng)540 nm處測(cè)吸光度值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活。

酶活定義：在上述條件下，每1 min催化底物CMC-Na產(chǎn)生1 μmol的葡萄糖所需的酶量為1個(gè)酶活單位，U/mL。

式中：m為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得葡萄糖質(zhì)量，mg；5.56為1 mg葡萄糖的物質(zhì)的量，μmol；n為酶液稀釋倍數(shù)；t為反應(yīng)時(shí)間，min；V為反應(yīng)酶量，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1 不同碳源對(duì)菌株YZB46產(chǎn)酶影響

由圖1可知，當(dāng)以CMC-Na為碳源時(shí)，菌株的酶活力最高[8]，以麩皮為碳源時(shí)，酶活力僅次于CMC-Na，桑枝粉和稻草粉可能富含較多的木質(zhì)素，阻礙菌株對(duì)纖維素的利用。從經(jīng)濟(jì)利用上考慮，選擇麩皮作發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源。

圖1 碳源對(duì)菌株YZB46產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effect of carbon sources on CMCase of strain YZB46

2.1.2 麩皮添加量對(duì)菌株YZB46產(chǎn)酶影響

圖2 麩皮添加量對(duì)菌株YZB46產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of wheat bran addition on CMCase of strain YZB46

由圖2可知，隨著麩皮添加量的增加，酶活性呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)添加1.5%的麩皮時(shí)，酶活達(dá)26.07 U/mL，繼續(xù)增加麩皮量酶活呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這與陳士成等[9]的報(bào)道類似，麩皮可誘導(dǎo)產(chǎn)酶。因此選擇麩皮添加量1.0%、1.5%、2.0%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.3 不同氮源對(duì)菌株YZB46產(chǎn)酶影響

圖3 氮源對(duì)菌柏油YZB46產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of nitrogen source on CMCase of strain YZB46

由圖3可知，黃豆粉的產(chǎn)酶活力最高，相對(duì)于其他氮源，其來源成本低廉，適合作發(fā)酵產(chǎn)酶氮源。無機(jī)氮源中，（NH4）2SO4比NH4NO3利用效果更好，因NH4+相對(duì)于NO3-更易于微生物吸收[10]。但無機(jī)氮源的產(chǎn)酶能力較有機(jī)氮源的產(chǎn)酶能力低，因此選擇黃豆粉作發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳氮源。

2.1.4 黃豆粉添加量對(duì)菌株YZB46產(chǎn)酶影響

圖4 黃豆粉添加量對(duì)菌株YZB46產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of soybean meal addition on CMCase of strain YZB46

由圖4可知，隨著黃豆粉添加量的上升，酶活性呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)添加0.6%的黃豆粉時(shí)，CMCase活力達(dá)最高，為28.51U/mL。因此選擇黃豆粉添加量0.4%、0.6%、0.8%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.5 MgSO4·7H2O添加量對(duì)菌株YZB46產(chǎn)酶影響

圖5 MgSO4·7H2O添加量對(duì)菌株YZB46產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of MgSO4·7H2O addition on CMCase of strain YZB46

由圖5可知，隨著MgSO4·7H2O添加量的上升，酶活性呈先上升后下降的趨勢(shì)。但對(duì)產(chǎn)酶影響變化不大，在0.10%～0.20%范圍內(nèi)CMCase活力都較高。因此選擇MgSO4·7H2O添加量0.10%、0.15%、0.20%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.6 KH2PO4添加量對(duì)菌株YZB46產(chǎn)酶影響

圖6 KH2PO4添加量對(duì)菌株YZB46產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of KH2PO4addition on CMCase of strain YZB46

由圖6可知，隨著KH2PO4添加量的上升，酶活性呈先上升后下降的趨勢(shì)。KH2PO4在添加量為0.4%的時(shí)候酶活力最高，因此選擇KH2PO4添加量0.2%、0.4%、0.6%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.7 培養(yǎng)基組分優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)L9（34）對(duì)菌株進(jìn)行產(chǎn)酶測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果與分析見表3，方差分析見表4。

表3 培養(yǎng)基組分優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for medium formula optimization

表4 培養(yǎng)基組分優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal tests results for medium formula optimization

由表3、表4可知，培養(yǎng)基成分中，各因素對(duì)纖維素酶活的影響大小順序?yàn)辂熎ぃ军S豆粉＞KH2PO4＞MgSO4，麩皮對(duì)酶活有顯著影響，從極差分析得出，最佳培養(yǎng)基組分組合為A2B2C1D2，即麩皮1.5%，黃豆粉0.6%，MgSO40.1%，KH2PO40.4%，該組合并未在正交表中，因此需將此次組合和試驗(yàn)中最大酶活的組合A2B3C1D2比較，結(jié)果見表5。

表5 不同組合發(fā)酵結(jié)果比較Table 5 Fermentation results comparison of different combinations

由表4可知，通過極差分析得到的組合A2B2C1D2的發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活（35.25 U/mL）優(yōu)于正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的組合A2B3C1D2（33.64 U/mL）。

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 不同初始pH對(duì)菌株YZB46產(chǎn)酶影響

圖7 初始pH對(duì)菌株YZB46產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effects of initial pH on CMCase of YZB46

由圖7可知，隨著初始pH值的上升，酶活性呈先上升后下降的趨勢(shì)。在初始pH 6.0酶活達(dá)最高，而堿性條件下對(duì)產(chǎn)酶有較大的影響，呈急劇下降趨勢(shì)，說明弱酸性條件下有利于產(chǎn)酶。因此選擇初始pH 5.0、6.0、7.0進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.2 不同發(fā)酵溫度對(duì)菌株YZB46產(chǎn)酶影響

圖8 溫度對(duì)菌株YZB46產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effects of temperature on CMCase of strain YZB46

由圖8可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，酶活力呈先上升后下降趨勢(shì)，在30℃時(shí)達(dá)到最高，說明高溫不利于菌株產(chǎn)酶。因此選擇25℃、30℃、35℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.3 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株YZB46產(chǎn)酶影響

圖9 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株YZB46產(chǎn)酶的影響Fig.9 Effects of fermentation time on CMCase of strain YZB46

由圖9可知，在24～144 h內(nèi)，前期菌體生長(zhǎng)，產(chǎn)酶量少，呈逐步升高趨勢(shì)，在72 h時(shí)達(dá)到產(chǎn)酶最高，72 h后產(chǎn)酶逐步下降，原因可能是營(yíng)養(yǎng)物減少，有害代謝物增多，影響菌株的生理活性，因此選擇發(fā)酵時(shí)間48 h、72 h、96 h進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.4 不同接種量對(duì)菌株YZB46產(chǎn)酶影響

圖10 接種量對(duì)菌株YZB46產(chǎn)酶的影響Fig.10 Effects of inoculum on CMCase of strain YZB46

由圖10可知，隨著接種量增加，酶活力逐步升高，接種量為8%時(shí)酶活力最高，繼續(xù)增加接種量，酶活開始下降，接種量過高導(dǎo)致溶氧不足，不利于菌株產(chǎn)酶，因此選擇接種量5%、8%、11%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.8 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)初始pH、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、接種量的4因素3水平正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果與分析見表6，方差分析見表7。

表6 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 6 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation conditions optimization

由表6、表7可知，發(fā)酵條件各因素對(duì)YZB46產(chǎn)纖維素酶的影響大小為：發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間＞接種量＞初始pH，其中溫度對(duì)酶活有顯著影響，得到最優(yōu)組合為A1B2C2D2，即初始pH5.0，溫度30℃，發(fā)酵72 h，接種量為8%，此組合在正交表中，酶活為37.69 U/mL。

表7 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 7 Variance analysis of orthogonal test results for fermentation conditions optimization

在最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3次試驗(yàn)，結(jié)果見表8。

表8 最優(yōu)組合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果Table 8 Verification results of the optimal combination

由表8可知，經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件的優(yōu)化，菌株YZB46的產(chǎn)酶活力達(dá)37.75 U/mL，在發(fā)酵優(yōu)化后產(chǎn)酶有所提升，從原來的17.08 U/mL提升至37.75 U/mL，是優(yōu)化前的2.21倍。

3 結(jié)論

本研究通過單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化了纖維素酶產(chǎn)生菌YZB46的產(chǎn)酶能力，菌株YZB46的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基碳源為1.5%麩皮，氮源為0.6%黃豆粉，無機(jī)鹽為0.1%MgSO4和0.4%KH2PO4；最佳發(fā)酵條件為接種量8%，發(fā)酵液初始pH 5.0，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時(shí)間72 h，在此條件下菌株YZB46的產(chǎn)酶活力達(dá)37.75 U/mL。菌株YZB46產(chǎn)酶條件屬弱酸性、低溫產(chǎn)酶[11]，發(fā)酵時(shí)間相對(duì)較短，低溫短時(shí)使酶在工業(yè)應(yīng)用上具有一定優(yōu)勢(shì)。關(guān)于桑園土壤來源的芽孢桿菌產(chǎn)酶研究鮮見報(bào)道，桑園中桑樹常因剪枝而產(chǎn)生大量桑枝條，而初步研究菌株YZB46的纖維素酶活力對(duì)桑枝粉的降解能力較低，這有待進(jìn)一步探索[12]。獲得高產(chǎn)酶的方法可以通過菌種篩選、培養(yǎng)條件優(yōu)化、基因改造等途徑，自然選育菌種穩(wěn)定性好，因此，本研究可在發(fā)酵條件優(yōu)化基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究環(huán)境因素的影響，通過多菌混合發(fā)酵[13]、誘變[14-16]或分子改造等方法開發(fā)菌株YZB46的產(chǎn)酶潛能。

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Fermentation conditions of cellulase-producing strain YZB46

LUO Fengfeng,MO Yaling,LIU Xintai,LI Xuefeng,QIN Yue*
(College of Chemical and Biological Engineering,Hechi University,Yizhou 546300,China)

In order to improve cellulase-producing capacity of strain YZB46,on the basis of single factor experiment,the optimal medium formula and fermentation conditions were optimized through orthogonal tests.The results showed that the optimal medium formula were as follows:carbon source was wheat bran 1.5%,nitrogen source was soybean meal 0.6%,organic salt was MgSO40.1%and KH2PO40.4%,and the optimal fermentation conditions were inoculum 8%,fermentation broth initial pH 5.0,and fermentation temperature 30℃,time 72 h.Under the above conditions,the activity of cellulase reached 37.75 U/ml,which was 2.21 times higher than the control.

cellulase;orthogonal test;enzyme activity;optimization

Q939.9

0254-5071（2016）11-0117-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.024

2016-05-01

廣西高?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（LX2014334）；河池學(xué)院廣西高校微生物及植物資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（2015HL008）；

河池學(xué)院重點(diǎn)科研課題（XJ2016ZD002）

羅奉奉（1986-），女，講師，碩士，研究方向?yàn)橘Y源環(huán)境微生物。

*通訊作者：覃玥（1970-），女，教授，碩士，研究方向?yàn)槲⑸锱c植物病害。