李飛，隋新*，蘇紅，代嬌陽，劉佳，張國峰

（吉林化工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，吉林吉林132022）

不同發(fā)酵條件對糙米酵素中活性成分的影響

李飛，隋新*，蘇紅，代嬌陽，劉佳，張國峰

（吉林化工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，吉林吉林132022）

發(fā)芽糙米酵素是以發(fā)芽糙米為主要原料，經(jīng)酵母發(fā)酵制成的功能性食品。發(fā)芽糙米酵素中含γ-氨基丁酸、谷胱甘肽、γ-谷維醇等多種生理功能活性成分。本試驗研究了蜂蜜添加量、酵母活化液添加量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度等因素對產(chǎn)品中谷胱甘肽、γ-氨基丁酸與淀粉酶活力的影響，并以γ-氨基丁酸含量為評價指標，通過Plackett-Burman試驗設(shè)計方法對其生產(chǎn)工藝進一步優(yōu)化。結(jié)果表明：當蜂蜜添加量為8%，發(fā)酵溫度為30℃，時間為3.9 h，酵母活化液添加量為13%時，γ-氨基丁酸的含量最高為0.80 mg/mL。

發(fā)芽糙米酵素；谷胱甘肽；γ-氨基丁酸；淀粉酶活力

發(fā)芽糙米酵素是以發(fā)芽糙米為主要原料，添加蜂蜜和水等輔料進行調(diào)配，經(jīng)酵母發(fā)酵制成的具有特殊保健功能的發(fā)酵類食品[1]。在發(fā)酵過程中酵母菌利用調(diào)配的營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生出多種復(fù)合酶類，其營養(yǎng)價值遠遠超過了發(fā)芽糙米本身[2]。發(fā)芽糙米酵素中富含γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、谷胱甘肽、γ-谷維醇等多種生理功能活性成分和β-胡蘿卜素、核黃酶、VE、B族維生素以及各種分解酵素、膳食纖維、鋅、鈣、鐵等成分[3]。通過這些成分的共同作用能幫助機體營養(yǎng)素迅速吸收、促進新陳代謝、并能活化細胞、調(diào)節(jié)生理平衡、減少各種疾病的發(fā)生、提高機體免疫力，從而可以達到增強人體健康的目的[4-6]。

發(fā)芽糙米酵素不僅可以直接食用，也可以作為產(chǎn)品改良劑或添加劑應(yīng)用于食品生產(chǎn)加工過程中。目前，其產(chǎn)地主要集中在日本和我國臺灣地區(qū)，并已研究開發(fā)出品種多樣的糙米酵素食品，而我國大陸地區(qū)的相關(guān)產(chǎn)品目前還處于起步階段。因此，研究發(fā)芽糙米酵素的相關(guān)工藝、發(fā)酵前后營養(yǎng)成分的變化及各種糙米酵素產(chǎn)品的開發(fā)就成為研究熱點。本研究測定在不同發(fā)酵條件下發(fā)芽糙米酵素中谷胱甘肽、γ-氨基丁酸、淀粉酶三種成分的含量的變化，并在此基礎(chǔ)上對發(fā)芽糙米酵素的生產(chǎn)工藝進行了優(yōu)化，旨在為今后的發(fā)芽糙米酵素產(chǎn)品開發(fā)提供一定的依據(jù)，為進一步推動糧食深加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，滿足消費者的需求提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糙米：黑龍江省寧安市萬佳米業(yè)有限公司；蜂蜜（百花椴樹蜜）：市售；活性干酵母：安琪酵母股份有限公司。

四硼酸鈉、苯酚、次氯酸鈉、乙醇（分析純）、GABA標準品、三氯丁酸、乙二胺四乙酸二鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、二硝基苯甲酸標準品、谷胱甘肽（glutathione，GSH）標準品、3,5-二硝基水楊酸、丙三醇、葡萄糖標準品、可溶性淀粉：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；蒸餾水（以下所用水均為蒸餾水）。

1.2 儀器與設(shè)備

DH-250恒溫培養(yǎng)箱：北京中興偉業(yè)有限公司；WGLL-65BE鼓風(fēng)干燥箱、DK98電熱恒溫水浴鍋：天津泰斯特儀器有限公司；DFY-1000高速粉碎機：上海德洋意邦儀器有限公司；DDL-5M高速離心機：湖南滬康離心機有限公司；T3紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)芽酵素生產(chǎn)工藝流程

1.3.2 單因素試驗[7-9]

1）蜂蜜添加量對各種活性成分的影響：取10 g發(fā)芽糙米粉分別于100 mL水中，分別添加2%、4%、6%、8%、10%、12%的蜂蜜，14%的酵母活化液，于培養(yǎng)皿中攪拌均勻，置于恒溫培養(yǎng)箱中32℃，發(fā)酵2 h，然后于鼓風(fēng)干燥機中干燥，粉碎后得到成品。測定谷胱甘肽、γ-氨基丁酸、淀粉酶活力三種活性成分含量。

2）酵母活化液添加量對各種活性成分的影響：取10 g發(fā)芽糙米粉分別于100 mL水中，分別添加6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%、20%的酵母活化液（取活性干酵母與40℃溫水，以1∶15的比例活化20 min），其他操作同上，得出酵母活化液最佳添加量。

3）發(fā)酵時間對各種活性成分的影響：分別置于恒溫培養(yǎng)箱中32℃，發(fā)酵1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h，其他操作同上，得出最佳發(fā)酵時間。

4）發(fā)酵溫度對各種活性成分的影響：取發(fā)芽糙米粉于6個培養(yǎng)皿中，分別置于28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃條件下，得出最佳發(fā)酵溫度。

1.3.3 測定方法

（1）γ-氨基丁酸含量的測定[10-11]

標準曲線的制作：分別取1 mg/mL標準GABA溶液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL于6個試管中，加水補足至1.0 mL，加1 mL四硼酸鈉緩沖溶液，1 mL重熏苯酚，7.5%的次氯酸鈉溶液5 mL，沸水浴10 min，冰浴5 min，然后加入體積分數(shù)60%乙醇2 mL，用分光光度計于波長640 nm處測定吸光度值，繪制標準曲線。

樣品的測定：取一定量的成品酵素加入體積分數(shù)60%乙醇（料液比為1∶5（g∶mL）），70℃水浴中回流提取2 h，取離心后上清液備用，取上清液1 mL，按照標準曲線的步驟操作，根據(jù)樣品吸光度值計算樣品中GABA含量。

（2）谷胱甘肽含量的測定

按照參考文獻[12]中的方法，測定樣品中的GSH的含量。

（3）淀粉酶活力的測定[13-14]

葡萄糖標準曲線的制作：分別取2 mg/mL葡萄糖標準溶液0、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL、1.8mL、2.0mL于25mL比色管，加水至2 mL，再加入3,5-二硝基水楊酸溶液3 mL，沸水顯色5 min，流水迅速冷卻后用水定容至25 mL，搖勻，在波長540 nm處測定吸光度值。以葡萄糖量（mg）為橫坐標，以吸光度值為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線。

樣品的測定：稱取2.5 g過100目的糙米酵素粉，加蒸餾水25 mL，在室溫下（25℃）放置提取30 min，每隔5 min攪動1次，使其充分提取。然后3000r/min離心10 min，將上清液倒入50mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，即為淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液5 mL，放入50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即為淀粉酶稀釋液。

取3支干凈的試管，編號，各加入1 mL淀粉酶稀釋液，1號試管中加入3,5-二硝基水楊酸溶液2 mL，將各試管置于40℃恒溫水浴中保溫10 min，各加入1%淀粉溶液1 mL，在40℃恒溫水浴中保溫5 min，在2、3號試管中分別加入2 mL的3,5-二硝基水楊酸溶液，按標準曲線方法測吸光度值，計算2、3號試管吸光度平均值與1號試管吸光度值之差，在標準曲線上查出相應(yīng)葡萄糖量（mg）。進而計算出樣品的淀粉酶活力（U/g）（40℃時，5 min內(nèi)水解單位質(zhì)量淀粉（1%的淀粉溶液）釋放1 mg葡萄糖所需酶量為1 U/g）[15]。

1.3.4 響應(yīng)面設(shè)計

綜合單因素試驗結(jié)果，選取發(fā)酵溫度、酵母活化液添加量、發(fā)酵時間3個因素為評價因素，以γ-氨基丁酸含量為響應(yīng)值，在單因素試驗基礎(chǔ)上采用3因素3水平的響應(yīng)面分析方法，優(yōu)化糙米的發(fā)酵條件。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果的確定

2.1.1 蜂蜜添加量的確定

圖1 蜂蜜添加量對各成分的影響Fig.1 Effect of honey addition on each ingredient

蜂蜜添加量對γ-氨基丁酸含量、谷胱甘肽含量、淀粉酶活力的影響見圖1。由圖1可知，蜂蜜添加量對三種活性成分含量的影響并不是很大，谷胱甘肽含量和淀粉酶活力隨著蜂蜜添加量升高而升高，谷胱甘肽含量在蜂蜜添加量8%處達到較高水平，γ-氨基丁酸含量一開始處于穩(wěn)定水平，在8%之后隨著蜂蜜添加量的增加，GABA含量有緩慢下降的趨勢，因此選擇蜂蜜添加量為8%為最佳。

2.1.2 酵母活化液添加量的確定

圖2 酵母活化液添加量對各成分的影響Fig.2 Effect of yeast active fluid addition on each ingredient

酵母活化液添加量對γ-氨基丁酸含量、谷胱甘肽含量、淀粉酶活力的影響見圖2。由圖2可以得出，隨著酵母活化液添加量的增加，GSH以及淀粉酶活力均呈上升的趨勢，GABA含量相對穩(wěn)定，添加量超過14%后，GABA和GSH含量變化平緩，而淀粉酶活力下降。因此本試驗選取酵母活化液添加量為14%。

2.1.3 發(fā)酵時間的確定

圖3 發(fā)酵時間對各成分的影響Fig.3 Effect of fermentation time on each ingredient

發(fā)酵時間對GSH、淀粉酶活力和GABA含量的影響見圖3。由圖3可知，當發(fā)酵時間從1 h增加至2 h時，淀粉酶活力迅速增加，之后隨著時間延長，淀粉酶活力基本上保持不變，而GABA和GSH的含量均在4 h的時候達到最大值，4 h后隨著時間的增加出現(xiàn)下降的趨勢，故最佳發(fā)酵時間選擇為4 h。

2.1.4 發(fā)酵溫度的確定

發(fā)酵溫度對各成分的影響見圖4。由圖4可知，淀粉酶活力在30℃時達到最大值，之后隨著溫度的升高而下降，GABA含量是在32℃時達到最高點，隨后隨著溫度的升高而漸近下降，而GSH含量起初則隨著溫度升高而出現(xiàn)上升的現(xiàn)象，在30℃達到最大值后開始下降，32℃開始一直處于較平穩(wěn)的含量，綜合考慮，發(fā)酵溫度取30℃為最佳。

圖4 發(fā)酵溫度對各成分的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on each ingredient

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件的結(jié)果

按照表1的響應(yīng)面設(shè)計方案進行響應(yīng)面試驗，結(jié)果如表2所示，方差分析結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of response surface methodology

表3 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of quadratic response surface regression model

續(xù)表

由于各因素對以γ-氨基丁酸含量的影響不是簡單的線性關(guān)系，為了更明確各因素對響應(yīng)值的影響，采用Plackett-Burman試驗設(shè)計方法對試驗數(shù)據(jù)進行分析，得到模型的多元回歸方程為：

由方程的顯著性分析可知，模型的F值為16.59，相應(yīng)的概率P=0.000 6，由方程顯著性檢驗可知，該方程的模型達到了極顯著（P＜0.01）。由失擬性分析可知，F(xiàn)2=0.43，相應(yīng)的概率P=0.745 5（P＜0.05），失擬性分析表明該方程無失擬性因素存在，回歸模型與實際值能較好的擬合。模型的變異系數(shù)為7.12，說明模型數(shù)據(jù)準確度較好，具有一定的可靠性；信噪比16.413＞4，表明模型可以用于實際預(yù)測。

各因素的F值可以反映出各因素對實驗指標的重要性，F(xiàn)值越大，表明對試驗指標的影響越大，即重要性越大。從F值分析可知，A、B、C的F值分別0.95、0.74、9.80，各因素影響程度從大到小依次為C＞A＞B，即酵母活化液添加量＞發(fā)酵時間＞發(fā)酵溫度。

2.3 響應(yīng)面結(jié)果分析

圖5為因素交互作用的響應(yīng)面和等高線圖，從圖中可知3個響應(yīng)曲面均開口向下，說明響應(yīng)值存在極大值。發(fā)酵溫度和活化液添加量的交互作用對GABA含量的影響更大。

圖5 發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、活化液添加量交互作用對GABA含量影響的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between fermentation temperature, time and active fluids on GABA content

2.4 最佳工藝驗證

通過模型分析可知，當蜂蜜添加量為8%，發(fā)酵溫度為29.77℃，時間為3.93 h，酵母活化液添加量為12.58%時，γ-氨基丁酸的預(yù)測含量為0.83 mg/mL。為了檢驗試驗結(jié)果與理論情況是否一致，并考慮更當好的應(yīng)用于實際生產(chǎn)，在發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時間3.9 h，酵母活化液添加量為13%條件下進行3次平行試驗，得γ-氨基丁酸實際含量為0.80 mg/mL，驗證值與預(yù)測結(jié)果接近，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的發(fā)酵條件可靠。

3 結(jié)論

本試驗研究了酵母活化液添加量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間等因素對發(fā)芽糙米酵素在發(fā)酵過程中γ-氨基丁酸含量、谷胱甘肽含量和淀粉酶活力大小的影響。試驗證明發(fā)酵時間對谷胱甘肽含量的影響最為顯著，酵母活化液添加量對淀粉酶活力的影響顯著，酵母活化液添加量對γ-氨基丁酸含量的影響最為顯著。為了更好的應(yīng)用于實際，采用發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時間3.9h，酵母活化液添加量為13%條件下進行驗證試驗，得γ-氨基丁酸實際含量0.80 mg/mL，與驗證值預(yù)測結(jié)果（0.83 mg/mL）基本吻合，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的發(fā)酵條件可靠。

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Effect of different fermentation conditions on the active ingredients in the brown rice leaven

LI Fei,SUI Xin*,SU Hong,DAI Jiaoyang,LIU Jia,ZHANG Guofeng
(College of Biological and Food Engineering,Jilin Institute of Chemical Technology,Jilin 132022,China)

Germinated brown rice leaven is fermented by yeast with germinated brown rice.It contains lots of active ingredients such as γ-amino butyric acid(GABA),glutathione,γ-oryzanol and so on.The effect of honey addition,yeast active fluid addition,fermentation time and temperature on glutathione,GABA and amylase activity was studied.Using GABA content as evaluation index,the process was optimized by response surface methodology.The results indicated that when honey addition was 8%,fermentation temperature was 30℃,time was 3.9 h,and yeast active fluid addition was 13%,the GABA content was the highest of 0.80 mg/ml.

brown rice leaven;glutathione;γ-amino butyric acid;amylase activity

TS210.5

0254-5071（2016）11-0162-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.034

2016-05-26

2016年度吉林省“大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃”項目

李飛（1982-），女，講師，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。

*通訊作者：隋新（1972-），男，副教授，碩士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。