河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院(張家口075000) 蘇 華 陳 琛 許玉環(huán) 李夢嘉

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環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法檢測人乳頭瘤病毒16、18的應(yīng)用研究*

河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院(張家口075000) 蘇 華 陳 琛 許玉環(huán) 李夢嘉

目的：環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)檢測人乳頭瘤病毒HPV16、18的應(yīng)用研究。方法：收集宮頸癌行HC-Ⅱ-HPV檢測標(biāo)本高危型的47例，低危型34例。陰性對照20例，分別利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(LAMP)方法和PCR方法進(jìn)行檢測，并對檢測結(jié)果進(jìn)行比對分析。結(jié)果：HC-Ⅱ-HPV篩查的高危組標(biāo)本中，LAMP檢出HPV16 和HPV18的陽性率分別是37%和6%，均高于PCR的31%和4%，在HC-Ⅱ-HPV篩查的低危組標(biāo)本中，LAMP法和PCR法均有高危型別的檢出。LAMP法略優(yōu)于PCR法，二者比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論：LAMP法在HPV高危型16、18的篩查中與PCR法無差異，然而LAMP法是更經(jīng)濟(jì)、便捷的HPV16、18 亞型篩查方法。

在婦科惡性腫瘤中，宮頸癌是僅次于乳腺癌的威脅婦女健康的第二殺手,全球每年大約有 47 萬婦女罹患宮頸癌。目前研究認(rèn)為，宮頸持續(xù)感染高危型HPV(HR-HPV)99%以上是宮頸癌發(fā)生的必要條件[1]，而其中70%的宮頸癌都是由HPVl6和18型感染引起[2]，因此病毒基因準(zhǔn)確分型對判斷疾病類型、判斷預(yù)后、監(jiān)測治療復(fù)發(fā)具有重要的意義，同時在HPV基因型流行狀況的地區(qū)性調(diào)查及基因疫苗的研制上都具有重要的科研價值。公認(rèn)的HPV檢測方法是雜交捕獲II代(Hybridcaptureassay-Ⅱ，HC-II)技術(shù)，然而該技術(shù)最大的缺點是不能具體分型。而PCR靈敏度高，是目前進(jìn)行HPV基因檢測及分型的主要策略，但因其對實驗條件要求高而不利于推廣應(yīng)用。環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(Loop-MediatedIsothermalAmplification,LAMP)技術(shù)是Notomi等2000年報道的一種新型等溫核酸擴(kuò)增方法。LAMP可以在等溫條件下實現(xiàn)擴(kuò)增，不需要精密實驗儀器，具有簡便、高效特異性強(qiáng)的特點。研究進(jìn)行了利用LAMP技術(shù)檢測人乳頭瘤病毒16型和18型的應(yīng)用研究，為建立快速、特異及敏感檢測HPV的方法提供依據(jù)。

材料與方法

1 標(biāo)本來源 收集我院2015年1～12月生殖中心宮頸癌行HC-Ⅱ-HPV檢測(試劑盒采用QIAGEN公司的digene檢測試劑盒，可檢測13種高危型HPV)的標(biāo)本101例，其中確認(rèn)為高危型的47例，低危型的34例。同時收集正常體檢行宮頸液基薄層細(xì)胞檢測(TCT)的標(biāo)本20例作為陰性對照。本實驗經(jīng)倫理觀察委員會論證通過。

2 樣本前處理 將送檢標(biāo)本充分振蕩混勻，15000r/min離心5min，棄上清，留沉淀，加600μl病毒DNA提取液充分混勻，加700μl異丙醇，振蕩混勻，12 000r/min離心1min，棄上清液，沉淀用75%乙醇洗滌2次，12 000r/min離心1min，棄上清液，將離心管倒置于濾紙上10～15min，待酒精揮發(fā)干凈后加入100μlTE溶液4℃過夜充分溶解DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增引物 通過GeneBank檢索HPV16、18目的基因片段，進(jìn)行同源性比對，選擇HPV16基因組E7外顯子和HPV18基因組E6區(qū)域設(shè)計引物，引物設(shè)計采用專業(yè)LAMP引物設(shè)計軟件(PrimerExplorerversion.3)。分別設(shè)計HPV-16、18正向外引物(F3)、反向外引物(B3)、正向內(nèi)引物(FIP)和反向內(nèi)引物(BIP)，還可通過設(shè)計兩條環(huán)引物使其反應(yīng)速度增加1/2-1/3。引物見表1。

表1 HPV16和HPV18LAMP寡核苷酸引物序列

4LAMP檢測 以待檢標(biāo)本為模板，反應(yīng)體系為50μl：3μl20μmol/L引物FIP和BIP，0.6μl20μlmol/L的引物F3和B3，7μl10mmol/LdNTP，8μl5mol/L三甲銨乙內(nèi)酯(betaine)，5μl10×Buffer，6μl25mmol/LMgSO4，1μlBstDNApolymerase(8U/μl)，DEPC水補(bǔ)充體積到50μl。95℃預(yù)變性，5min，65℃反應(yīng) 60min，80℃2min終止反應(yīng)。取10μlLAMP反應(yīng)液于2%瓊脂糖凝膠電泳觀察。于反應(yīng)管中加入1.0μl熒光探測試劑(SLP221，榮研生物科技有限公司)，混勻后，65℃30min，在紫外光下觀察反應(yīng)液顏色變化，也可肉眼直接觀察其沉淀物。

5PCR反應(yīng) 以待檢標(biāo)本為模板，以HPV16、18F3、B3引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系：10×ReactionBuffer2.5.0μl，HPV16、18DNA模板1μl，dNTP(5mmol/L)1.0μl，F(xiàn)3(10μmol/L)和B3(10μmol/L)各1μl，TaqDNApolymerase(5U/μl)1μl，加DEPC處理水至總體積25μl。反應(yīng)條件：92℃ 3min； 92℃ 30sec，60℃ 45sec，72℃ 1min35個循環(huán)；72℃ 5min；4℃保存。取5μl擴(kuò)增產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

6 統(tǒng)計學(xué)方法 所有實驗數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析,離散趨勢以百分率表示；率間的比較用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 成功建立了HPV16和HPV18的LAMP法檢測方法 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)后，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察到明顯的階梯狀產(chǎn)物條帶如圖1，在產(chǎn)物中加入1.0μl熒光探測試劑，在紫外光下可觀察到熒光沉淀，也可直接肉眼觀察渾濁和沉淀，結(jié)果見圖2。以HPV16、18F3、B3引物進(jìn)行PCR反應(yīng)后，凝膠電泳結(jié)果如圖3，得到323bp的HPV18核酸片段和454bp的HPV16核酸片段。

圖1 1:LAMP法檢測HPV16陽性條帶;2:LAMP法檢測HPV18陽性條帶。

圖2 A肉眼直接觀察反應(yīng)結(jié)果，對比可見陽性反應(yīng)管；

圖3 1:PCR法檢測HPV18，得到323bp核酸片段；2:PCR法檢測HPV16，得到454bp核酸片段。

2 樣本檢測結(jié)果 在47例雜交捕獲高危組(HC-Ⅱ-HPV高危組)中，LAMP法檢出HPV16陽性標(biāo)本17(37)例，HPV18陽性的標(biāo)本3 (6)例；用PCR法檢出HPV16陽性標(biāo)本15(31)例，HPV18陽性的標(biāo)本2(4)例?？梢奓AMP法陽性檢出率高于PCR法，但是二者比較無顯著性差異(P>0.05)。34例雜交捕獲低危組(HC-Ⅱ-HPV低危組)中，LAMP法檢出HPV16陽性標(biāo)本2(6)例，HPV18無陽性檢出；PCR法檢出HPV16陽性標(biāo)本1(3)2例，HPV18無陽性檢出。說明在HC-Ⅱ-HPV低危組中仍有高危HPV型的檢出，LAMP檢出率略高于PCR，但二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

正常對照組中，LAMP法檢出1(5)例HPV16陽性標(biāo)本。

表2 LAMP法和PCR法檢測HPV16、18結(jié)果[n(%)]

注：c2檢驗, P>0.05，LAMP與PCR檢出率無顯著性差異

討 論

子宮頸癌是嚴(yán)重威脅女性健康的疾病之一，且發(fā)病年齡趨于年輕化，在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病率中僅次于乳腺癌，但病死率卻居第1位。持續(xù)的高危型人乳頭瘤病毒(HPV)感染是宮頸上皮內(nèi)瘤變或癌變(CIN3+)的高度相關(guān)因素。因此，子宮頸癌的治療關(guān)鍵是早期診斷。已知宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展與HPV感染密切相關(guān)。Zeng等[3]收集了中國人51245例樣本，進(jìn)行了我國HPV基因型分布的研究，研究發(fā)現(xiàn)HPV的健康人群感染率為26%，其中21.12%為正高危型HPV，8.37%為低危型HPV，HPV的陽性感染病例80%是單一HPV型別感染，三種最常見的高危HPV類型依次是HPV-52，-16，和-58，HPV18排在第六位，其中HPV16與HPV18宮頸癌高度相關(guān)。因此HPV16和HPV18單一基因型別的檢測在宮頸癌的鑒別診斷、判斷預(yù)后、監(jiān)測治療復(fù)發(fā)都具有潛在的重要的意義。

目前，HPV檢測方法應(yīng)用較普遍的是雜交捕獲II代(HC-II)技術(shù)，該技術(shù)對宮頸癌篩查均有較高的的特異性和靈敏度，然而其最大的缺點是不能具體分型。PCR雖然在HPV分型研究中發(fā)揮了重要作用，但其高昂的成本使其不利于進(jìn)行臨床標(biāo)本的大量篩查。LAMP方法是近年來興起的一種新型快速檢測核酸的分子生物學(xué)方法，由于LAMP引物的設(shè)計針對靶基因的位點比PCR多，其反應(yīng)特異性顯著高于常規(guī)PCR， 且不需要精密實驗儀器，擴(kuò)增效率高。

本實驗建立了LAMP技術(shù)檢測HPV16、18的方法，并通過臨床標(biāo)本的檢測和PCR方法的比對進(jìn)行了應(yīng)用研究。研究結(jié)果顯示經(jīng)過HC-Ⅱ-HPV篩查的高危組標(biāo)本中，LAMP檢出HPV16 37%的陽性率和HPV18 6%的陽性率，均高于PCR的31%和4%，說明其在HPV高危型16、18的篩查中優(yōu)于PCR法，但是由于二者均具有較高的特異性，比較無統(tǒng)計學(xué)差異。同時在HC-Ⅱ-HPV篩查的低危組病例中，LAMP法和PCR法均有高危型別的檢出，且LAMP法略優(yōu)于PCR法，說明LAMP法在高危型的篩查中優(yōu)于HC-Ⅱ法，提示其在單一高危型別篩查中的優(yōu)勢和良好的推廣前景。

LAMP判斷結(jié)果的方法簡便快捷，可在反應(yīng)產(chǎn)物中加入熒光顯色劑，在紫外光下觀察結(jié)果，進(jìn)行定性判斷，也可以通過直接肉眼觀察即可以鑒定其陰陽性?？梢奓AMP法在結(jié)果判斷方面與常規(guī)的PCR方法相比，更為簡便迅速、易于操作。Kumvongpin等[4]研制了一種可以連接到單鏈DNA上的納米粒子探針(AuNPs)，用于檢測HPV16和HPV18，通過納米粒子顏色變化來判斷LAMP產(chǎn)物濁度的變化，從而進(jìn)行定性分析。LAMP納米粒子實驗顯示了更高的靈敏度和實用性。此外該納米粒子探針穩(wěn)定性大于1年，LAMP和納米粒子探針的組合為HPV16和HPV18篩查在地區(qū)醫(yī)院開展提供了更簡便快捷且，高度敏感的替代的工具。在LAMP定量實驗的研究中Jearanaikoon等[5]研究發(fā)現(xiàn)，通過石英晶體微生物傳感器(Auartzcrystalmicrobalancebiosensor)，可定量檢測HPV16的濃度，進(jìn)一步確認(rèn)HPV單基因型感染與疾病的關(guān)系，使LAMP的定量檢測成為可能?？傊S著LAMP技術(shù)的進(jìn)一步成熟和完善，其必能在病原體基因檢測方面發(fā)揮重要作用并逐漸應(yīng)用于臨床。

[1]YildirimJ,G,ArabaciZ.InnovationsinHPVVaccinationandRolesofNursesinCervicalCancerPrevention[J].AsianPacJCancerPrey,2014,15(23):10053-10056.

[2] 李 勤,馮艷紅,楊永康.宮頸不典型鱗狀細(xì)胞156例臨床分析[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志,2012,41(2):165-166.

[3]ZengZ,YangH,LiZ, et al.PrevalenceandGenotypeDistributionofHPVInfectioninChina:Analysisof51,345HPVGenotypingResultsfromChina'sLargestCAPCertifiedLaboratory[J].Cancer,2016 ,7(9):1037-1043.

[4]KumvongpinR,JearanaikoolP,WilailuckanaC, et al.Highsensitivity,loop-mediatedisothermalamplificationcombinedwithcolorimetricgold-nanoparticleprobesforvisualdetectionofhighriskhumanpapillomavirusgenotypes16and18[J].VirolMethods,2016,234(4):90-95.

[5]JearanaikoonP,PrakrankamanantP,LeelayuwatC, et al.Theevaluationofloop-mediatedisothermalamplification-quartzcrystalmicrobalance(LAMP-QCM)biosensorasareal-timemeasurementofHPV16DNA[J].JVirolMethods, 2016 ,229(5):8-11.

(收稿：2016-05-18)

*河北省衛(wèi)生廳青年基金項目(20120158)

人乳頭狀瘤病毒16 人乳頭狀瘤病毒18 多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) @雜交捕獲二代技術(shù)

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Adoi:10.3969/j.issn.1000-7377.2016.12.003

河北省張家口市科技計劃項目(12110051D)