李旭峰，張慧霞，凱德麗艷·阿布都外力，陳 艷，2，*

（1. 新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，新疆 烏魯木齊 830011；2.浙江省嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 嘉興 314001）

葉酸在MNNG影響哈薩克族食管上皮細胞DNMT1酶活性及表達中的作用

李旭峰1，張慧霞1，凱德麗艷·阿布都外力1，陳 艷1，2，*

（1. 新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，新疆 烏魯木齊 830011；2.浙江省嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 嘉興 314001）

食管癌(esophageal cancer，EC)是發(fā)生于食管上皮組織的常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤，最早期的變化特征是上皮細胞增生異常，在食管癌發(fā)生的分子機制中，遺傳學(xué)的改變是不可逆的，而表觀遺傳學(xué)的改變在一定的條件下是可以逆轉(zhuǎn)的，其中DNA甲基化是腫瘤發(fā)生的表觀學(xué)遺傳機制之一[1]。葉酸維持基因組正常甲基化的功能，主要與S-腺苷甲硫氨酸的合成有關(guān)。S-腺苷甲硫氨酸是細胞內(nèi)各種甲基化反應(yīng)的通用供體，它最主要的合成途徑是通過同型半胱氨酸接受5-甲基四氫葉酸的甲基基團生成甲硫氨酸，甲硫氨酸在腺苷轉(zhuǎn)移酶的作用下轉(zhuǎn)變成S-腺苷甲硫氨酸。因此，一旦葉酸缺乏將造成甲基來源不足而影響核酸的甲基化。DNA甲基化是通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNAmethyltransferases，DNMTs)將甲基從S-腺苷甲硫氨酸轉(zhuǎn)移到胞嘧啶來完成的。DNA異常甲基化過程總是伴隨著DNMTs的異常表達[2]。DNMT1的功能是使僅有一條鏈甲基化的DNA的雙鏈完全甲基化，其作為持續(xù)性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，可參與DNA新合成鏈的甲基化，直接與組蛋白去乙酰基轉(zhuǎn)移酶聯(lián)合作用阻斷轉(zhuǎn)錄。在DNA復(fù)制和修復(fù)中維持其甲基化，這種維持作用可以將DNA甲基化信息傳遞給子代細胞。我國是食管癌發(fā)病率和死亡率最高的國家，而新疆則是哈薩克族食管癌高發(fā)區(qū)[3]，可能的原因之一是腌制食物食用過多，而腌制食物中的亞硝胺類物質(zhì)是一種與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的外源性化學(xué)物[4]。甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG)是一種人工合成的亞硝胺類化合物。我們前期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)喜燙茶，經(jīng)常喝奶茶、吃酸奶疙瘩、吃熏肉、蔬菜水果攝入量低以及吃燙飯和食速快是食管癌的危險因素，而經(jīng)常喝酸奶和多吃新鮮蔬菜則是食管癌的保護因素[5]。眾所周知蔬菜水果是葉酸的主要來源，而葉酸缺乏則與多種癌癥有關(guān)[6]。因此，本實驗應(yīng)用MNNG對哈薩克族食管上皮細胞染毒，觀察不同葉酸濃度對MNNG致哈薩克族食管上皮細胞DNMT1酶活性及表達水平的影響，為探討食管癌的發(fā)生機制以及預(yù)防提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要儀器

哈薩克族食管上皮細胞(自制)[7]。CO2恒溫培養(yǎng)箱

購自日本SANYO公司；低溫離心機購自日本SONY 公司；實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；酶標(biāo)儀購自上海新振儀器有限公司；磁力攪拌器購自中國溫州醫(yī)療電器廠；DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀購自上海琪特公司；凝膠成像系統(tǒng)購自上海復(fù)日科公司。

1.2 試劑

葉酸購自美國Sigma公司；EpiCM-2培養(yǎng)基購自美國ScienCell公司；MethylCodeTMBisulfite Conversion Kit購自美國Invitrogen公司；SYBR Premix Ex TaqTMII購自美國TaKaRa公司；MNNG購自日本TCI公司；EPiQuikTMOne-Step DNAhydrolysis，EPiQuikTMNuclear Extraction KitⅠ、EPiQuikTMDNMT1 Assay Kit均購自美國EPigentek公司；E.Z.N.ATMTissue DNA Kit購自美國Omega公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)及細胞染毒方法 哈薩克族食管上皮細胞常規(guī)培養(yǎng)于1×EpicM-2(含葉酸)與1×EpicM-2(無葉酸)無血清培養(yǎng)基中。37℃、CO2體積分數(shù)為5%的孵育箱中培養(yǎng)，當(dāng)細胞生長至匯合度約為90%時按1∶1或1∶2傳代培養(yǎng)。采用3因素3水平(3×3)析因設(shè)計將體外培養(yǎng)的哈薩克族食管上皮細胞分別暴露于不同濃度葉酸(0.000、0.400、0.800μg/mL)和MNNG (0.000、0.750、1.500μg/mL)的培養(yǎng)液中作用48、72和96h。

1.3.2 ELISA法檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1的活性 分別使用核蛋白提取試劑盒和蛋白濃度測定試劑盒提取細胞核蛋白并進行蛋白濃度測定。標(biāo)準(zhǔn)曲線建立，取0.8mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)配置液加入到1管蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(20mg BSA)中，充分消融后即為25mg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，于-20℃長期保存。按50∶1的比例配制BCA工作液，充分混勻。將標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、4、8、12、16、20μL依次加入到96孔板中，加PBS至每孔體積為20μL。加10μL核蛋白樣品到96孔板中，每個樣品重復(fù)3次，加PBS至終體積20μL。加入200μL BCA工作液，37℃孵育30min后于562 nm波長處檢測各孔D(562)值。DNA甲

基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)活性的檢測按照酶活性檢測試劑盒進行，采用雙波長檢測法在2～10min于450 nm波長處(參比波長655 nm)檢測各孔吸光度D(450)值。

DNMT1活性=[實驗組D(450)值－空白孔D(450)值]/[對照組D(450)值－空白孔D(450)值]×100%

1.4 DNMT1mRNA及蛋白表達水平檢測

1.4.1 細胞內(nèi)總RNA抽提、完整性及純度檢測 細胞內(nèi)的抽提采用總RNA提取試劑盒，收集細胞，用3mL PBS洗滌細胞2次，棄上清。加入1mL Trizol充分勻漿，室溫靜置5min。加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15 s，靜置3min。4℃、12 000 r/min離心10min，取上清。加入0.5mL異丙醇，混勻，冰上靜置20～30min。4℃、12 000 r/min離心10min，棄上清。加入1mL 75%乙醇，洗滌沉淀。4℃、300 r /min離心5min，棄上清。室溫放置晾干吹干，加入適量的RNase-freeh2O溶解。將提取的RNA進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性。核酸分析儀檢測在波長260和280 nm處的吸光度比值[D(260)/D(280)]，確定RNA的純度及濃度。

1.4.2 cDNA合成 采用第一鏈cDNA合成試劑盒合成cDNA。將其混勻后37℃溫浴5min，42℃溫浴60min，70℃溫浴10min，終止反應(yīng)，將上述溶液-20℃保存。

1.4.3 PCR引物 逆轉(zhuǎn)錄PCR所使用的引物采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計，由上海生工公司合成，以管家基因GAPDH為內(nèi)參。引物序列見表1。

表1 逆轉(zhuǎn)錄PCR引物序列

1.4.4 實時熒光定量PCR法檢測DNMT1mRNA PCR儀自動分析結(jié)果，根據(jù)陰性對照調(diào)整閾值和基線以確定各個標(biāo)本的CT值 ，并根據(jù)熔解曲線確定該CT值是否有效。將結(jié)果導(dǎo)出，采用2-△△CT法分析目的基因在對照組和各濃度組之間的表達差異，計算公式如下：△CT= CT，目的基因－CT，內(nèi)參，再求得對照組△CT的 平均值，記為△CT，對照，用各組的△CT分別減去△CT，對照，求得△△CT值 ，即△△CT=△CT，樣本－△CT，對照，再計算各組2-△△CT值，即為各組中基因的相對表達量。

1.4.5 Western blot法檢測DNMT1蛋白表達 采用BCA法對所提取的蛋白定量。配制10%的分離膠8mL及5%的濃縮膠4mL，立即用去離子水緩慢覆蓋膠面室溫放置約40min至分離膠凝固。倒掉去離子水，加入5%濃縮膠液，插入樣品梳，加樣。經(jīng)離心后取上清，用考馬斯亮藍試劑盒經(jīng)紫外可見分光光度計測定蛋白濃度。根據(jù)蛋白定量結(jié)果，加入相應(yīng)體積的總蛋白樣品與4×蛋白質(zhì)凝膠電泳上樣緩沖液，混合，95℃變性10min，室溫平衡。電泳儀進行電泳。電泳結(jié)束后，使用PVDF進行轉(zhuǎn)膜，然后分別用非標(biāo)記一抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗對其進行孵育、檢測。經(jīng)顯影定影液顯色，根據(jù)條帶的亮度以及背景情況可以再次選擇曝光時間進行二次曝光。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，測得的DNMT1酶活性、RNA及蛋白水平數(shù)據(jù)用(±s)表示，獨立實驗均重復(fù)3次，采用3因素3水平析因設(shè)計的方差分析進行統(tǒng)計分析，采用LSD法進行兩兩比較，以α=0.05 為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性

2.1.1 核蛋白濃度檢測和標(biāo)準(zhǔn)方程的建立 根據(jù)核蛋白標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線和二元一次方程，標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)方程為y=0.921x+0.095，[y為D(450)值，x為核蛋白濃度，單位mg/mL]按照標(biāo)準(zhǔn)方程算出各組細胞提取的核蛋白濃度均大于2.10mg/mL，滿足檢測甲基轉(zhuǎn)移酶1活性所需濃度要求。

2.1.2 葉酸及MNNG作用后細胞DNMT1酶活性的改變 ELISA法檢測DNMT1酶活性指標(biāo)的結(jié)果見表2。不同濃度葉酸、MNNG作用細胞不同時間后，在固定MNNG濃度和時間因素下，隨著葉酸濃度的增加DNMT1酶活性逐漸降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F= 175.246，P< 0.01)；在固定葉酸濃度和時間，不同MNNG濃度作用下的哈薩克族食管上皮細胞DNMT1酶活性不同，隨著MNNG濃度的增加DNMT1酶活性逐漸升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=826.553，P<0.01)；固定MNNG和葉酸濃度，不同時間點作用下的哈薩克族食管上皮細胞DNMT1酶活性不同，隨著干預(yù)時間的延長DNMT1酶活性逐漸升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F= 106.392，P< 0.01)。葉酸濃度與MNNG濃度之間、MNNG濃度與作用時間之間均存在交互作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=38.003，P<0.01；F=21.459，P<0.01)； 不同葉酸濃度與不同作用時間之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.371，P>0.05)；葉酸濃度、MNNG濃度及作用時間之間不存在交互作用，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.737， P>0.05)。為更好的體現(xiàn)葉酸在細胞DNMT1酶活性中的作用，表中可看出雖然細胞DNMT1酶活性隨MNNG濃度增高及

時間延長而逐漸增高，但葉酸具有改善作用，且隨著葉酸濃度的增加改善作用更加明顯(P<0.05 或P<0.01)。

2.2 葉酸及MNNG作用后細胞DNMT1m RNA的表達

2.2.1 RNA完整性檢測 哈薩克族食管上皮細胞經(jīng)不同濃度葉酸和不同濃度MNNG作用48、72、96h后，分別提取的總RNA經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，可見兩條清晰的RNA條帶：18 S和28 S，說明RNA提取成功，RNA完整性好，無降解。波長260和280 nm處的吸光度比值[D(260)/D(280)]均在1.9～2.1之間，提取的RNA濃度在200～600 ng/L之間。

2.2.2 DNMT1mRNA表達水平 實時熒光定量PCR法檢測DNMT1酶mRNA指標(biāo)的結(jié)果見表3。固定MNNG濃度和作用時間，不同葉酸濃度作用下的哈薩克族食管上皮細胞DNMT1mRNA表達水平不同，隨著葉酸濃度的增加DNMT1mRNA 表達水平逐漸降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=217.462，P<0.01)；固定葉酸濃度和時間，不同MNNG濃度作用下的哈薩克族食管上皮細胞DNMT1mRNA表達水平不同，隨著MNNG濃度的增加DNMT1mRNA表達水平逐漸升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=1 118.042，P<0.01)；固定MNNG和葉酸濃度，不同作用時間下的哈薩克族食管上皮細胞DNMT1mRNA表達水平不同，隨著干預(yù)時間的延長DNMT1mRNA表達水平逐漸升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F= 105.384，P< 0.01)。葉酸濃度與MNNG濃度之間、MNNG濃度與作用時間之間存在交互作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=62.023，P<0.01；F=20.421，P<0.01)；不同葉酸濃度與不同作用時間之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.304， P>0.05)。葉酸濃度、MNNG濃度及作用時間之間不存在交互作用，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.518，P>0.05)； 為更好的體現(xiàn)葉酸在細胞DNMT1mRNA表達水平中的作用，表中可看出雖然細胞DNMT1mRNA表達水平隨MNNG濃度增高及時間延長而逐漸增高，但葉酸具有改善作用，且隨著葉酸濃度的增加改善作用更加明顯(P<0.05，P<0.01)。

表2 不同濃度葉酸及MNNG作用細胞不同時間后DNMT1酶活性的改變(n=3，±s)

表2 不同濃度葉酸及MNNG作用細胞不同時間后DNMT1酶活性的改變(n=3，±s)

在固定MNNG濃度及作用時間的條件下：與0.00μg/mL葉酸組比較，*P<0.05、**P<0.01；與0.40μg/ml葉酸組比較，#P<0.05、##P<0.01；與0.80μg/mL葉酸組比較，△P<0.05、△△P<0.01.

表3 不同濃度葉酸及MNNG作用細胞不同時間后DNMT1mRNA相對表達水平的改變(n=3，±s)

表3 不同濃度葉酸及MNNG作用細胞不同時間后DNMT1mRNA相對表達水平的改變(n=3，±s)

在固定MNNG濃度及作用時間的條件下：與0.00μg/mL葉酸組比較，*P<0.05、**P<0.01；與0.40μg/mL葉酸組比較，#P<0.05、##P<0.01；與0.80μg/mL葉酸組比較，△P<0.05、△△P<0.01.

2.3 葉酸及MNNG作用后DNMT1蛋白的表達水平

Western blot法檢測DNMT1蛋白指標(biāo)的結(jié)果見圖1和表4。固定MNNG濃度和時間，不同葉酸濃度作用下的哈薩克族食管上皮細胞DNMT1蛋白表達水平不同，隨著葉酸濃度的增加DNMT1蛋白表達水平逐漸降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=7 138.952，P<0.01)；固定

葉酸濃度和時間，不同MNNG濃度作用下的哈薩克族食管上皮細胞DNMT1蛋白表達水平不同，隨著MNNG濃度的增加DNMT1 蛋白表達水平逐漸升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=1 251.658，P<0.01)；固定MNNG和葉酸濃度，不同時間點作用下的哈薩克族食管上皮細胞DNMT1蛋白表達水平不同，隨著干預(yù)時間的延長DNMT1蛋白表達水平逐漸升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3 045.419，P<0.01)。不同葉酸濃度與不同MNNG濃度之間、不同葉酸濃度與不同作用時間之間、不同MNNG濃度與不同作用時間之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=53.613，P<0.05；F=62.818，P<0.05；F=66.389，P <0.05)，葉酸濃度、MNNG濃度及作用時間之間均存在交互作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F= 69.530，P<0.05)。為更好的體現(xiàn)葉酸在細胞DNMT1蛋白表達水平中的作用，表中可看出雖然細胞DNMT1蛋白表達水平隨MNNG濃度增高及時間延長而逐漸增高，但葉酸具有改善作用，且隨著葉酸濃度的增加改善作用更加明顯(P<0.05或P<0.01)。

圖1 不同濃度葉酸及MNNG作用細胞不同時間后DNMT1蛋白表達水平的改變

表4 不同濃度葉酸及MNNG作用細胞不同時間后DNMT1蛋白表達水平的改變(n=3，±s)

表4 不同濃度葉酸及MNNG作用細胞不同時間后DNMT1蛋白表達水平的改變(n=3，±s)

在固定MNNG濃度及作用時間的條件下：與0.00μg/mL葉酸組比較，*P<0.05、**P<0.01；與0.40μg/mL葉酸組比較，#P<0.05、##P<0.01；與0.80μg/mL葉酸組比較，△P<0.05、△△P<0.01.

3 討 論

葉酸是一種體內(nèi)廣泛分布的B族維生素，葉酸水平的低下能引起DNA甲基化紊亂，減低DNA修復(fù)和合成效率，從而引起抑癌基因和癌基因表達異常，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[8]。目前認為葉酸預(yù)防惡性腫瘤的機制主要與其維持DNA正常甲基化有關(guān)[9]。有關(guān)于葉酸與食管癌關(guān)系的Meta分析表明，血清葉酸水平與食管癌的危險性呈負相關(guān)[10]。郝婷等[11]對哈薩克族食管癌患者血清維生素含量的研究結(jié)果顯示哈薩克族食管癌患者血清葉酸水平普遍偏低。近年來有學(xué)者[12]提出亞硝酸胺類化合物可能是引起食管癌的病因之一，N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)是一種人工合成的亞硝胺類化合物，通常使用亞硝胺類化合物作為誘發(fā)腫瘤實驗的研究。本次實驗在經(jīng)葉酸干預(yù)后，葉酸可通過與MNNG發(fā)生拮抗作用而抑制致癌物對食管上皮的進一步損傷，但隨著時間的增加，這種拮抗作用也會減弱。單一葉酸缺乏能夠抑制哈薩克族食管上皮細胞生長，但并不明顯。

本次試驗通過檢測DNMT1酶活性，結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度MNNG染毒48、72、96h后，隨著MNNG濃度的增加以及作用時間的延長，哈薩克族食管上皮細胞DNMT1酶活性均逐漸升高，同時還發(fā)現(xiàn)葉酸與MNNG

之間存在一定的交互作用，充足的葉酸可能通過影響DNMT1活性從而達到減少毒物的損傷作用，進而起到降低食管上皮細胞癌變的可能性。

高波等[13]對原發(fā)性肝癌患者肝組織和肝癌細胞系的DNMTsmRNA表達的差異，發(fā)現(xiàn)在肝癌組織和肝癌細胞系中DNMT1的mRNA水平升高。Derya等[14]分別取18例新診斷的白血病患兒和18例健康兒童的外周血檢測DNMT1mRNA表達水平，發(fā)現(xiàn)白血病患兒的DNMT1mRNA表達水平高于健康兒童。已有較多研究表明，葉酸可以調(diào)控DNMT1的表達，然而葉酸水平究竟上調(diào)還是抑制DNMT1表達尚存在爭議。本次試驗通過qPCR和Western blot法分別檢測各組哈薩克族食管上皮細胞DNMT1mRNA及蛋白表達水平。結(jié)果顯示無葉酸無MNNG組葉酸缺乏能夠促使細胞DNMT1mRNA及蛋白表達上調(diào)，再經(jīng)MNNG染毒48、72及96h后，哈薩克族食管上皮細胞DNMT1mRNA及蛋白表達水平均表達上調(diào)，且隨MNNG濃度的增高及作用時間的延長DNMT1mRNA及蛋白表達水平也逐漸上調(diào)，但同等條件下葉酸充足組細胞DNMT1mRNA及蛋白表達水平均明顯低于葉酸缺乏組及無葉酸組。以此表明，葉酸的缺乏會加劇MNNG對細胞DNMT1mRNA及蛋白表達的影響，而充足的葉酸則可對MNNG的影響起到一定的抑制作用。

[1] Ishiguroh，Kimuram，Takahashih，etal.GADD45A expression is correlated with patient prognosisin esophageal cancer[J].Oncol Lett，2016，11(1)：277-282.

[2] Farias N，Ho N，Butler S，etal.The effects of folic acid on global DNAmethylation and colonosphere formation in colon cancer cell lines[J].J Nutr Biochem，2015，26(8)：818-826.

[3] 劉真群，張慧霞，陳艷.新疆伊犁哈族食管癌高發(fā)區(qū)飲用水“三氮”含量分析[J].中國公共衛(wèi)生，2014，30(7)：940-943.

[4] RobertmF，Morin SN，Gauthier F，etal.DNMT1 is required tomaintain CpGmethylation and aberrant gene silencing inhuman cancer cells[J].Nat Genet，2003，33(1)：61-65.

[5] 張慧霞，陳艷，尹東，等.新疆哈薩克族食管癌危險因素的探討[J].現(xiàn) 代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2009，36(10)：1804-1806.

[6] 張廣平，王立東，馮笑山.遺傳與環(huán)境在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用[J].醫(yī) 學(xué)與哲學(xué)，2008，29(5)：35-36.

[7] 黃思語，阿爾孜古麗·吐爾遜，鄧彥超，等.哈薩克族食管上皮細胞的原代培養(yǎng)方法[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2014，37(3)：277-279.

[8] 宋京翔.葉酸缺乏介導(dǎo)的腫瘤相關(guān)基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)異常與散發(fā)性結(jié)直腸癌發(fā)生的相關(guān)性研究[D].上海：第二軍醫(yī)大學(xué)，2010.

[9] Fang JY，Xiao SD.Folic acid，polymorphism ofmethyl-groupmetabolism genes，and DNAmethylation in relation to GI carcinogenesis[J].J Gastroenterol，2003，38(9)：821-829.

[10] 尹鈺，帕力達·托了汗，陳艷.葉酸水平與食管癌關(guān)系的Meta分析[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2015(6)：748-753.

[11] 郝婷，吐爾遜江·買買提明，王艷萍，等.新疆新源縣234名哈薩克族居民營養(yǎng)狀況及葉酸水平與食管癌關(guān)系的研究[J].新 疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2011，34(4)：429-431.

[12] Enzinger PC，Mayer RJ.Medical progress：esophageal cancer [J].N Engl Jmed，2003(23)：2241-2252.

[13] 高波，李海平，余宗濤，等.原發(fā)性肝癌組織及細胞系中DNMTm RNA表達的檢測及意義[J].檢 驗醫(yī)學(xué)，2013，2 8(8)：63-66.

[14] Derya BS，Halil GK，Ezer U，etal.Dnamethyltransferase expression differs with proliferation in childhood acute lymphoblastic leukemia[J].Mol Biol Rep，2010，37(5)：2476-2471.

Effectof folic acid onmNNG-treated esophageal epithelial cells and expressionof DNMT1 enzyme activity

LI Xufeng1，ZHANGhuixia1，KADIRYA·Abduwali1，CHEN Yan1，2，*
(1.Departmentof Toxicology, College of Publichealth of Xinjiangmedical University, Urumqi 830011, Xinjiang; 2.Medicine School of Jiaxing University, Jiaxing 314001, Zhejiang, China)

目的： 探討葉酸在N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)影響哈薩克族食管上皮細胞DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)活性及表達中的作用，為食管癌的防治提供理論依據(jù)。方法：采用3因素3水平(3×3)析因設(shè)計將體外培養(yǎng)的哈薩克族食管上皮細胞分別暴露于不同濃度葉酸(0.000、0.400、0.800μg/mL)和MNNG(0.000、0.750、1.500μg/mL)的培養(yǎng)液中作用48、72和96h后，采用ELISA法檢測DNMT1酶活性；采用RT-PCR的方法檢測DNMT1mRNA表達水平；采用Western blot法檢測DNMT1蛋白的表達水平。結(jié)果：不同濃度葉酸、MNNG作用細胞不同時間后，在固定MNNG濃度和時間因素下，隨著葉酸濃度的增加DNMT1酶活性、DNMT1mRNA和蛋白表達水平均逐漸降低(P均<0.01)；固定葉酸濃度和時間，隨著MNNG濃度的增加DNMT1酶活性、DNMT1mRNA和蛋白表達水平均逐漸升高(P均<0.01)；固定MNNG和葉酸濃度，隨著干預(yù)時間的延長DNMT1 酶活性、DNMT1mRNA和蛋白表達水平均逐漸升高(P均<0.01)；葉酸濃度與MNNG濃度之間、MNNG濃度與作用時間之間均存在交互作用(P<0.01)。不同葉酸濃度與不同MNNG濃度之間、不同葉酸濃度與不同作用時間之間、不同MNNG濃度與不同作用時間之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：葉酸濃度降低對MNNG影響哈薩克族食管上皮細胞DNMT1酶活性及表達有一定的激發(fā)作用，對食管癌的發(fā)生有一定的促進作用，而保持充足的葉酸則對MNNG的損害起到一定的保護作用。

葉酸；MNNG；食管上皮細胞；DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1；哈薩克族

OBJECTIVE:To investigate the effects of folic acid on N-methyl-N-nitro-N'-nitrosoguanidine (MNNG)-treated esophageal epithelial cells，in expressionof DNMT1 activity and to provide a theoretical basis for the prevention and treatmentof esophageal cancer.METHODS：Using a 3 factors and 3 levels (3×3) factorial design，esophageal epithelial cellsin culture were exposed to different concentrations of folic acid (0.000，0.400，0.800μg/mL) andmNNG (0，0.750，1.500μg/mL) for 48，72 and 96h.DNAmethyltransferase activity was detected by ELISA； DNMT1mRNA expression by RT-PCR；DNMT1 protein expression by Western blotmethod.RESULTS： Treatmentof cells with different concentrations of folic acid andmNNG and in different times，ata fixedmNNG concentration and time factors，and with increasing concentrations of folic acid，the DNMT1 activity，DNMT1mRNA and protein expression levels all gradually decreased (P<0.01).By fixing folic acid concentrations and time，and with increasing concentrations ofmNNG，DNMT1 enzyme activity，DNMT1mRNA and protein expression levels all increased (P<0.01).By fixing themNNG and folic acid concentrations with intervention，the extensionof time of DNMT1 activity，DNMT1mRNA and protein expression levels all gradually

folic acid；MNNG；esophageal epithelial cells；DNAm ethyltransferases 1；Kazakh

R73-3

A

1004-616X(2016)06-0458-06

1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.06.009

2016-04-15；

2016-10-11

國家自然科學(xué)基金資助項目(81460502)；新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項目(醫(yī)學(xué)聯(lián)合基金)(2014211C002)

作者信息： 李旭峰，E-mail：lxftxdy@qq.com。*通信作者，陳 艷，E-mall：ychen88@sina.com

increased (P<0.01).There were interactions betweenmNNG concentrations and action time，and folic acid andmNNG concentrations (P<0.01).There were significant differences between different concentrations of folic acid and differentaction time，between differentmNNG concentrations and different time of action (P<0.05).CONCLUSION：Lower folate concentrationshad a negative impacton the expression and effectofmNNG on DNMT1 activity in esophageal epithelial cells.The results suggest that folic acid played a role in promoting the occurrence of esophageal carcinoma，andhad a protective effectagainstmNNG toxicity.