文哲瑤 陳燕銘

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·述評(píng)·

PFKFB3促進(jìn)糖尿病視網(wǎng)膜微血管損傷

文哲瑤 陳燕銘

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病的主要微血管并發(fā)癥，其主要病理改變?yōu)橐暰W(wǎng)膜微血管滲漏、血管新生等。6-磷酸果糖激酶-2/2,6雙磷酸激酶同工酶3(PFKFB3)作為糖酵解的關(guān)鍵酶，在血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)，當(dāng)受到低氧、炎癥刺激因子、生長(zhǎng)因子等因素刺激時(shí)其表達(dá)上調(diào)并對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的能量代謝發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。近期研究發(fā)現(xiàn)PFKFB3可通過(guò)促進(jìn)糖酵解、加快細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞凋亡等多種途徑促進(jìn)細(xì)胞的增殖，同時(shí)通過(guò)影響內(nèi)皮細(xì)胞的偽足生成、亞型分化等過(guò)程促進(jìn)細(xì)胞的遷移，在以上兩個(gè)過(guò)程的作用下加速血管新生的進(jìn)程，從而促進(jìn)DR的發(fā)生發(fā)展。

糖尿病視網(wǎng)膜病變；6-磷酸果糖激酶-2/2,6雙磷酸激酶同工酶3；內(nèi)皮細(xì)胞；血管新生

Endothelial cell; Angiogenesis

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，也是工作年齡人群的首位致盲性眼病[1-3]。2型糖尿病成年患者中，有20%～40%合并DR，8%有嚴(yán)重視力喪失[4]。DR的發(fā)生發(fā)展源于視網(wǎng)膜微血管病變，主要病理改變包括視網(wǎng)膜炎癥、視網(wǎng)膜微血管通透性增加和視網(wǎng)膜異常血管新生等。盡管諸多研究集中于DR，但由于發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前仍未完全闡明。

6-磷酸果糖激酶-2/2,6雙磷酸激酶又稱(chēng)誘導(dǎo)型6-磷酸果糖激酶-2，可通過(guò)激活6-磷酸果糖激酶-1從而促進(jìn)糖酵解。有研究證實(shí)，在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的糖酵解速率明顯高于其他細(xì)胞，如肝細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，能量代謝速率幾乎與腫瘤細(xì)胞相當(dāng)[5]。而促進(jìn)糖酵解的關(guān)鍵酶6-磷酸果糖激酶-2/2,6雙磷酸激酶同工酶3(PFKFB3)在內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)并通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)已證實(shí)PFKFB3參與血管新生，當(dāng)抑制PFKFB3表達(dá)時(shí)，血管生成受到明顯抑制[5-8]。因此，PFKFB3及其下游信號(hào)通路可能是DR發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)控途徑。

一、 PFKFB3概述

PFKFB3是一類(lèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)2,6-雙磷酸果糖水平的雙功能酶，在調(diào)節(jié)糖脂代謝中起重要作用。PFKFB家族由4種同工酶組成，分別由PFKFB1-4基因編碼。這4種同工酶均含有兩個(gè)催化中心，具有使6-磷酸果糖磷酸化生成2,6-雙磷酸果糖的激酶活性以及使2,6-雙磷酸果糖去磷酸化生成6-磷酸果糖的磷酸酶活性，不同之處在于每種同工酶的激酶/磷酸酶活性比有差異。其中PFKFB3基因(位于人類(lèi)10號(hào)染色體上)編碼的3號(hào)同工酶較其他3個(gè)同工酶而言，具有最高的激酶/磷酸酶活性比(其激酶活性約為磷酸酶活性的700倍，而其他3個(gè)同工酶該比值接近1∶1)，它幾乎僅表現(xiàn)出促進(jìn)2,6-雙磷酸果糖生成的作用[9-12]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)雖然4種同工酶在組織細(xì)胞中存在共表達(dá)的情況，比如在原代人上皮細(xì)胞中4種同工酶的mRNA均有表達(dá)，在小鼠成纖維細(xì)胞中則檢測(cè)到PFKFB2-4 mRNA的表達(dá)，但是4種同工酶對(duì)糖酵解的影響程度不盡相同，在敲除了PFKFB3基因的小鼠體內(nèi)細(xì)胞中2,6-雙磷酸果糖在細(xì)胞內(nèi)的水平下降最為顯著[13]。這提示了細(xì)胞內(nèi)2,6-雙磷酸果糖的水平主要受PFKFB3的調(diào)控。

當(dāng)PFKFB3基因受到低氧、炎癥刺激因子、生長(zhǎng)因子等因素刺激時(shí)其表達(dá)上調(diào)，它編碼的產(chǎn)物也表現(xiàn)出更高的激酶活性，通過(guò)促進(jìn)2,6-雙磷酸果糖的生成，繼而激活6-磷酸果糖激酶-1，起到提升糖酵解速率的作用[14-19]。

基于PFKFB3主要通過(guò)調(diào)節(jié)糖酵解途徑的速率而發(fā)揮作用。目前已知具有較高糖酵解速率的腫瘤細(xì)胞，其存在“Warburg效應(yīng)”(由Warburg教授在1926年首次提出)，即在氧氣供應(yīng)充足的情況下其糖酵解途徑的速率也明顯高于正常細(xì)胞。有研究則表明，在腫瘤組織中PFKFB3的表達(dá)量也顯著高于正常組織[16]。此外，腫瘤組織中PFKFB3表達(dá)水平上調(diào)與DNA合成的時(shí)相相關(guān)，在G1中后期和S期PFKFB3的表達(dá)量明顯升高，且在S期達(dá)到峰值，當(dāng)沉默PFKFB3基因可阻滯細(xì)胞進(jìn)入S期從而抑制細(xì)胞增殖，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡[16, 20-22]。當(dāng)抑制PFKFB3基因表達(dá)時(shí)腫瘤組織的生長(zhǎng)也明顯減緩[24-25]。以上表明PFKFB3通過(guò)促進(jìn)糖酵解、加快細(xì)胞周期、抑制凋亡等多種途徑參與細(xì)胞的增殖。

二、 PFKFB3與DR

1.DR的微血管病理改變

DR是糖尿病最主要的微血管并發(fā)癥之一，依據(jù)是否出現(xiàn)病理性血管增殖可將DR分為非增殖性視網(wǎng)膜病變(NPDR)和增殖性視網(wǎng)膜病變(PDR)兩類(lèi)。

視網(wǎng)膜毛細(xì)血管主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞組成，兩者結(jié)構(gòu)功能的完整對(duì)維持視網(wǎng)膜毛細(xì)血管穩(wěn)定性具有十分重要的作用[26]。DR早期的病理改變?yōu)槊?xì)血管周細(xì)胞減少、內(nèi)皮細(xì)胞增生及基底膜增厚，這些因素導(dǎo)致毛細(xì)血管的完整性受到破壞等并使其管腔變得狹窄。而高血糖導(dǎo)致的血流動(dòng)力學(xué)改變進(jìn)一步使得毛細(xì)血管阻塞，最終導(dǎo)致毛細(xì)血管閉塞。閉塞的毛細(xì)血管失去灌注，進(jìn)一步加劇了局部視網(wǎng)膜組織缺血缺氧，導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管損傷，進(jìn)一步發(fā)展則可出現(xiàn)黃斑水腫、新生血管形成和纖維化，即進(jìn)展為PDR[27-28]。

新生血管的形成與發(fā)展是PDR的關(guān)鍵，病理性增殖的新生血管可從視網(wǎng)膜延伸至玻璃體內(nèi)。新生血管脆弱易出血，可導(dǎo)致玻璃體內(nèi)出血，當(dāng)機(jī)化條索形成時(shí)可引發(fā)牽拉性視網(wǎng)膜脫離，影響視力甚至致盲。而當(dāng)眼球前段虹膜也出現(xiàn)新生血管時(shí)，其可向前房角生長(zhǎng)并阻塞小梁網(wǎng)使房水流出受阻，眼內(nèi)壓升高，隨后視神經(jīng)因灌注受損出現(xiàn)萎縮。由此可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖以及血管新生可貫穿于整個(gè)DR發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，對(duì)其干預(yù)可成為治療DR的重要途徑。

2.PFKFB3促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移

放射性示蹤標(biāo)記技術(shù)追蹤糖進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行代謝的不同途徑，發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有更高的糖酵解速率，甚至可與腫瘤細(xì)胞的糖酵解速率相當(dāng)。它的糖酵解速率約為其他供能途徑(如脂肪酸氧化、谷氨酰胺氧化等)速率的200倍。近85%的ATP通過(guò)糖酵解生成，而有氧呼吸的作用卻不如前者顯著(內(nèi)皮細(xì)胞葡萄糖氧化、脂肪酸氧化或谷氨酰胺氧化的速率不及糖酵解速率的1%)。而且內(nèi)皮細(xì)胞中線粒體體積不及細(xì)胞總體積的5%[5]。有學(xué)者則提出，在內(nèi)皮細(xì)胞中線粒體的作用更多的是發(fā)揮信號(hào)樞紐而非為細(xì)胞供能[30]?；趦?nèi)皮細(xì)胞對(duì)糖酵解途徑的依賴(lài)，使得調(diào)節(jié)糖酵解途徑的酶對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的作用不容忽視。

PFK-1是糖酵解途徑中重要的限速酶，它最強(qiáng)的變構(gòu)激活劑即為PFKFB3，抑制PFKFB3基因表達(dá)可使糖酵解速率降低35%～40%[30]。當(dāng)視網(wǎng)膜病變研究中最常用的細(xì)胞模型——臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)處于低氧狀態(tài)(氧氣濃度0.5%)或使用血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)干預(yù)后，可觀察到PFKFB3的mRNA及蛋白表達(dá)水平均有明顯上調(diào)[7]。而予以3PO(抑制PFKFB3基因表達(dá)的小分子化合物)干預(yù)或使用腺病毒轉(zhuǎn)染HUVEC抑制其PFKFB3基因表達(dá)后，處于靜息期的HUVEC比例增大，且其增殖和遷移均受到抑制[6-7]。然而，更進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，抑制PFKFB3基因表達(dá)所引起的上述改變卻并非由于糖酵解途徑受阻導(dǎo)致細(xì)胞供能不足所致。

當(dāng)抑制HUVEC的PFKFB3基因表達(dá)后，通過(guò)測(cè)定其ATP、ADP及AMP濃度發(fā)現(xiàn)它的能量負(fù)荷(即在總的腺苷酸系統(tǒng)中所負(fù)荷的高能磷酸基數(shù)量：[ATP]+1/2[ADP]/[ATP]+[ADP]+[AMP])以及ATP的濃度并未降低，沒(méi)有出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激、自噬增強(qiáng)或引發(fā)細(xì)胞死亡。但同時(shí)，沉默PFKFB3基因后的HUVEC也沒(méi)有觀察到葡萄糖氧化、脂肪酸氧化或呼吸作用的增強(qiáng)以抵償由于糖酵解途徑受阻而帶來(lái)的能量損失。而為了維持ATP的水平，沉默PFKFB3基因的HUVEC則是相應(yīng)地減低了ATP的消耗，其高耗能過(guò)程均減弱(如蛋白質(zhì)合成、內(nèi)皮細(xì)胞增殖等)并且促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入靜息態(tài)(G0期)[5]。這表明當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞糖酵解途徑受抑制后，細(xì)胞并未出現(xiàn)供能不足的情況，也未通過(guò)其他供能途徑代償性活躍來(lái)代替受阻的糖酵解途徑產(chǎn)能，而是通過(guò)抑制細(xì)胞的高耗能過(guò)程，從而建立了一個(gè)新的能量代謝平衡來(lái)適應(yīng)能量供應(yīng)降低的境況。

以上均表明，糖酵解在內(nèi)皮細(xì)胞中占有重要地位，而PFKFB3基因作為一個(gè)代謝基因通過(guò)調(diào)控糖酵解途徑從而可顯著影響內(nèi)皮細(xì)胞能量代謝，進(jìn)而影響其自身增殖以及細(xì)胞功能。前面我們提到，在DR發(fā)生的早期即NPDR時(shí)期，視網(wǎng)膜微血管的主要病理改變?yōu)橹芗?xì)胞喪失所引起的內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度增殖，PFKFB3與此過(guò)程密不可分，抑制PFKFB3基因的表達(dá)可顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖且促進(jìn)其進(jìn)入靜息態(tài)，在早期則可延緩DR的發(fā)展。

3.PFKFB3促進(jìn)血管新生

血管新生指在原有毛細(xì)血管基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)內(nèi)皮基膜降解，內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、分化、出芽或內(nèi)填方式形成新生血管的過(guò)程。而PFKFB3則可通過(guò)影響內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和功能從而調(diào)節(jié)血管新生。

小管形成實(shí)驗(yàn)為一種研究體外血管新生的模型，研究發(fā)現(xiàn)在該模型中沉默內(nèi)皮細(xì)胞PFKFB3基因后其血管形成率較對(duì)照組降低了約40%～46%，而過(guò)表達(dá)PFKFB3基因后血管形成率則較對(duì)照組升高了約52%～60%[7]。2013和2014年有研究先后發(fā)現(xiàn)，在另一種血管新生的體外模型——內(nèi)皮細(xì)胞球中，過(guò)表達(dá)或沉默該模型中內(nèi)皮細(xì)胞的PFKFB3基因抑或抑制PFKFB3基因的表達(dá)后，內(nèi)皮細(xì)胞球的新生血管芽數(shù)量和長(zhǎng)度均與PFKFB3基因表達(dá)量改變的趨勢(shì)一致[5-6]。而以上結(jié)果，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中同樣得到了印證。在研究血管生成的典型模型——斑馬魚(yú)模型中，3PO可抑制斑馬魚(yú)胚胎體節(jié)間血管(ISV)的生成，且這些生成的ISV存在灌注障礙[6]。而更細(xì)化到視網(wǎng)膜方面，在給予腹腔注射3PO或敲除PFKFB3基因的新生小鼠模型中，其視網(wǎng)膜的新生血管數(shù)、血管分支數(shù)、血管叢徑向膨脹程度都明顯減少，視網(wǎng)膜新生血管叢的面積較對(duì)照組小鼠小50%～55%[5-7]。此外，在高氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變小鼠模型中，當(dāng)高氧引起小鼠視網(wǎng)膜微血管損傷導(dǎo)致視網(wǎng)膜灌注受損后，將小鼠放回正常氧濃度環(huán)境中飼養(yǎng)，其視網(wǎng)膜則會(huì)反應(yīng)性地出現(xiàn)大量新生血管且部分為無(wú)功能血管，這一病理過(guò)程近似于糖尿病視網(wǎng)膜病變，而自小鼠回到正常氧濃度環(huán)境中時(shí)就給予腹腔注射3PO，5 d后將視網(wǎng)膜鋪片染色可觀察到新生血管明顯少于對(duì)照組小鼠[6]。這些實(shí)驗(yàn)證據(jù)均表明，PFKFB3可促進(jìn)血管新生，而無(wú)論在生理或病理狀態(tài)下抑制PFKFB3基因表達(dá)均可以抑制血管新生。

血管新生過(guò)程中內(nèi)皮細(xì)胞可分化為不同的亞型：位于血管芽前端的端細(xì)胞伸出絲狀偽足和板狀偽足，它極少增殖而是發(fā)揮向?qū)ё饔茫槐?xì)胞跟隨于端細(xì)胞之后，主要通過(guò)增殖發(fā)揮延長(zhǎng)血管芽的作用；一旦新生血管得到灌注后，內(nèi)皮細(xì)胞即進(jìn)入靜息狀態(tài)成為方陣細(xì)胞[31-32]。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，沉默PFKFB3基因后對(duì)血管新生的影響，則主要通過(guò)影響血管生成過(guò)程中端細(xì)胞的生物活性和功能以及它偽足的生成和遷移來(lái)調(diào)節(jié)血管新生[5]。

因此，在血管新生層面，PFKFB3同樣具有顯著的作用。即在出現(xiàn)了新生血管的PDR時(shí)期，若抑制PFKFB3基因的表達(dá)，除了影響內(nèi)皮細(xì)胞的能量代謝而抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖外，它還通過(guò)影響內(nèi)皮細(xì)胞的功能(偽足生成、亞型分化等)而抑制血管芽的形成從而抑制血管新生，這一作用有助于延緩PDR的進(jìn)展。

三、結(jié) 語(yǔ)

隨著全球糖尿病人數(shù)的不斷增長(zhǎng)，DR患者的人群也在不斷擴(kuò)大，目前大多對(duì)DR發(fā)生發(fā)展過(guò)程中內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度增殖和病理性血管新生的研究都集中在抑制VEGF的作用上，然而其成效卻并不顯著且已發(fā)現(xiàn)有諸多不良效應(yīng)，因此我們需要轉(zhuǎn)換視角，去尋求一種新的抗血管生成的策略。由于在血管內(nèi)皮細(xì)胞從靜息期轉(zhuǎn)入活動(dòng)期，進(jìn)行血管發(fā)生作用的時(shí)候，糖酵解作用是血管內(nèi)皮細(xì)胞的一大供能途徑，因此通過(guò)影響糖酵解途徑來(lái)調(diào)控血管生成即成為一條值得關(guān)注的途徑。PFKFB3基因作為調(diào)控糖酵解途徑的一個(gè)重要代謝基因，雖然迄今為止關(guān)于其在DR中的作用研究仍有限，但從目前已有的研究結(jié)果看來(lái)，通過(guò)調(diào)節(jié)PFKFB3改善內(nèi)皮細(xì)胞功能及病理性的血管新生從而干預(yù)DR的病理進(jìn)程可能成為一個(gè)有效的治療策略。對(duì)PFKFB3與DR的關(guān)系進(jìn)行更進(jìn)一步深入的研究，將為DR發(fā)病機(jī)制的研究提供新的方向。

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(本文編輯：楊江瑜)

PFKFB3 promotes microvascular injury in diabetic retinopathy

WenZheyao,ChenYanming.

DepartmentofEndocrinology&Metabolism，theThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity，Guangzhou510630，China

,ChenYanming,E-mail:yanmingch@qq.com

Diabetic retinopathy (DR) is one of major microvascular complications of diabetes mellitus. DR is mainly pathologically characterized with retinal microvascular leakage and angiogenesis, etc. As a key enzyme during glycolysis, 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase-3(PFKFB3) is highly expressed in vascular endothelial cells. The expression of PFKFB3 is up-regulated by hypoxia, inflammatory cytokines and growth factor, and plays a vital role in regulating the energy metabolism of vascular endothelial cells. Recent researches have demonstrated that PFKFB3 may accelerate cell proliferation via promoting glycolysis, accelerating cell cycle and suppressing cell apoptosis, etc. Meantime, PFKFB3 could promote cell mitigation through affecting the filopodia formation and subtype differentiation of endothelial cells. These activities can accelerate the progress of angiogenesis, thereby promoting the occurrence and progression of DR.

Diabetic retinopathy; 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase-3;

10.3969/j.issn.0253-9802.2016.11.001

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2016A050502010)；中山大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)研究5010計(jì)劃項(xiàng)目(2015015)；廣州市科學(xué)研究專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目(2060404)

510630 廣州，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝病學(xué)科

，陳燕銘，E-mail: yanmingch@qq.com

2016-06-06)

簡(jiǎn)介：陳燕銘，女，醫(yī)學(xué)博士，主任醫(yī)師，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院副院長(zhǎng)，粵東醫(yī)院常務(wù)副院長(zhǎng)、內(nèi)分泌科主任?，F(xiàn)任中華醫(yī)學(xué)會(huì)內(nèi)分泌學(xué)會(huì)青年委員會(huì)副主任委員，廣東省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)慢病防治及管理專(zhuān)業(yè)委員會(huì)主任委員，廣東省女醫(yī)師協(xié)會(huì)糖尿病專(zhuān)業(yè)委員會(huì)主任委員，廣東省老年保健專(zhuān)業(yè)委員會(huì)副主任委員，梅州市醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì)主任委員,《中華內(nèi)分泌代謝雜志》通訊編委。曾于美國(guó)加州大學(xué)圣地亞哥分校、美國(guó)俄克拉荷馬大學(xué)任訪問(wèn)學(xué)者。作為通訊作者或第一作者在Diabetes、Diabetologia等國(guó)際著名學(xué)術(shù)刊物發(fā)表論著，主編或參編專(zhuān)著3部；目前主持或參與國(guó)家及省、市級(jí)科研基金18項(xiàng)，先后發(fā)表科研論文70余篇，其中SCI論著16篇。